Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari ^5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all’altro all’interno dello stesso organismo) e il trasferimento genico orizzontale (HGT, il movimento del DNA tra due organismi) hanno dato origine a una quantità vertiginosa di eterogeneità genetica tra B. burgdorferi (per un esempio, vedi Schutzer et ^al.7). I genotipi risultanti (o “ceppi”) sono tutti membri della stessa specie, ma hanno differenze genetiche che influenzano la loro capacità di trasmettere e infettare diversi ospiti di mammiferi 8,9,10,11. In questa relazione, il termine “ceppo” sarà utilizzato per riferirsi a B. burgdorferi con un particolare background genetico di derivazione naturale; Il termine “clone” sarà utilizzato per riferirsi a un ceppo che è stato geneticamente modificato per uno scopo particolare o come risultato di manipolazione sperimentale.

La cassetta degli attrezzi molecolare disponibile per l’uso in B. burgdorferi include marcatori selezionabili, segnalatori genici, vettori shuttle, mutagenesi dei trasposoni, promotori inducibili e marcatori controselezionabili (per una revisione, vedi Drektrah e Samuels¹²). L’uso efficace di queste metodologie richiede l’introduzione artificiale di DNA eterologo (estraneo) in un ceppo di interesse di B. burgdorferi. In B. burgdorferi, l’introduzione del DNA eterologo è ottenuta quasi esclusivamente tramite elettroporazione, un metodo che utilizza un impulso di elettricità per rendere una membrana batterica transitoriamente permeabile a piccoli pezzi di DNA introdotti nei mezzi¹. La maggior parte delle cellule (stimate in ≥99,5%) vengono uccise dall’impulso, ma le cellule rimanenti hanno un’alta frequenza di trattenere il DNA eterologo¹³. Sebbene sia considerato uno dei metodi più efficienti per introdurre il DNA nei batteri, la frequenza di elettroporazione in B. burgdorferi è molto bassa (che va da 1 trasformante in 5 × 10⁴ a 5 × 10⁶ cellule)¹³. Gli ostacoli al raggiungimento di frequenze di trasformazione più elevate sembrano essere sia tecnici che biologici. Gli ostacoli tecnici al successo dell’elettroporazione di B. burgdorferi includono sia la quantità di DNA (>10 μg) necessaria sia il requisito che le spirochete siano esattamente nella corretta fase di crescita (mid-log, tra 2 × 10 7 cellule·mL−1 e 7 × 10⁷ cellule·mL⁻¹) durante la preparazione di cellule elettrocompetenti^12,13. Queste barriere tecniche, tuttavia, possono essere più facili da superare rispetto alle barriere biologiche.

I ricercatori della malattia di Lyme riconoscono che i cloni di B. burgdorferi possono essere divisi in due grandi categorie rispetto alla loro capacità di essere manipolati geneticamente^13,14. Gli isolati adattati in laboratorio ad alto passaggio sono spesso facilmente trasformabili, ma di solito hanno perso i plasmidi essenziali per l’infettività, si comportano in modo fisiologicamente aberrante e non sono in grado di infettare un ospite di mammifero o persistere all’interno di un vettore zecca^12,13. Mentre questi cloni sono stati utili per sezionare la biologia molecolare della spirocheta all’interno del laboratorio, sono di scarso valore per lo studio della spirocheta nel contesto biologico del ciclo enzootico. Gli isolati infettivi a basso passaggio, invece, si comportano in maniera fisiologica riflettente uno stato infettivo e possono completare il ciclo infettivo ma di solito sono recalcitranti all’introduzione di DNA eterologo e sono, quindi, difficili da manipolare per lo studio^12,13. La difficoltà nel trasformare gli isolati a basso passaggio è legata ad almeno due diversi fattori: (i) gli isolati a basso passaggio spesso si raggruppano strettamente, in particolare nelle condizioni di alta densità richieste per l’elettroporazione, bloccando così molte cellule dalla piena applicazione della carica elettrica o dall’accesso al DNA nei mezzi^13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica almeno due diversi sistemi di modificazione della restrizione trasmessa da plasmidi (R-M) che possono essere persi negli isolati ad alto passaggio^14,16. I sistemi R-M si sono evoluti per consentire ai batteri di riconoscere ed eliminare il DNA estraneo¹⁷. Infatti, diversi studi su B. burgdorferi hanno dimostrato che l’efficienza di trasformazione aumenta quando la fonte del DNA è B. burgdorferi piuttosto che Escherichia coli^13,16. Sfortunatamente, acquisire l’alta concentrazione di DNA necessaria per l’elettroporazione da B. burgdorferi è una prospettiva costosa e dispendiosa in termini di tempo. Un’altra potenziale preoccupazione quando si elettroporano e si selezionano isolati a basso passaggio è che il processo sembra favorire i trasformanti che hanno perso il plasmide associato alla virulenza critica, lp25^14,18,19; pertanto, l’atto stesso di manipolare geneticamente isolati di B. burgdorferi a basso passaggio tramite elettroporazione può selezionare cloni che non sono adatti per analisi biologicamente rilevanti all’interno del ciclo enzootico²⁰. Dati questi problemi, un sistema in cui il DNA eterologo potrebbe essere elettrotrasformato in cloni di B. burgdorferi ad alto passaggio e quindi trasferito in isolati infettivi a basso passaggio con un metodo diverso dall’elettroporazione potrebbe essere una gradita aggiunta alla crescente collezione di strumenti molecolari disponibili per l’uso nella spirocheta della malattia di Lyme.

Oltre alla trasformazione (l’assorbimento del DNA nudo), ci sono altri due meccanismi attraverso i quali i batteri assumono regolarmente DNA eterologo: la coniugazione, che è lo scambio di DNA tra batteri in contatto fisico diretto tra loro, e la trasduzione, che è lo scambio di DNA mediato da un batteriofago²¹. Infatti, la capacità del batteriofago di mediare l’HGT è stata utilizzata come strumento sperimentale per sezionare i processi molecolari all’interno di un certo numero di sistemi batterici^22,23,24. B. burgdorferi non è naturalmente competente per l’assorbimento del DNA nudo, e ci sono poche prove che B. burgdorferi codifichi l’apparato necessario per promuovere una coniugazione di successo. Precedenti studi hanno descritto, tuttavia, l’identificazione e la caratterizzazione preliminare di φBB-1, un batteriofago temperato di B. burgdorferi^25,26,27,28. φBB-1 racchiude una famiglia di plasmidi da 30 kb trovati in B. burgdorferi²⁵; I membri di questa famiglia sono stati designati CP32. Coerentemente con il ruolo di φBB-1 nella partecipazione all’HGT tra i ceppi di B. burgdorferi, Stevenson et al. hanno riportato un cp32 identico trovato in due ceppi con cp32 altrimenti disparati, suggerendo una recente condivisione di questo cp32 tra questi due ceppi, probabilmente tramite trasduzione²⁹. Ci sono anche prove di una significativa ricombinazione tramite HGT tra i cp32 in un genoma 30,31,32,33 altrimenti relativamente stabile. Infine, la capacità di φBB-1 di trasdurre sia cp32s che DNA vettoriale shuttle eterologo tra cellule dello stesso ceppo e tra cellule di due ceppi diversi è stata dimostrata in precedenza^27,28. Alla luce di questi risultati, φBB-1 è stato proposto come un altro strumento da sviluppare per la dissezione della biologia molecolare di B. burgdorferi.

L’obiettivo di questo rapporto è quello di dettagliare un metodo per indurre e purificare il fago φBB-1 da B. burgdorferi, oltre a fornire un protocollo per eseguire un saggio di trasduzione tra cloni di B. burgdorferi e selezionare e selezionare potenziali trasduttori.