ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

スピロヘータ細菌ボレリア・ブルグドルフェリの遺伝子操作のためのツールの開発は、ライム病の性質の理解に計り知れない価値を追加しました1,2,3,4。B. burgdorferiは、小さな線状染色体と直鎖状および環状プラスミドの両方からなる異常に複雑なゲノムを持っています^5,6。自発的なプラスミド喪失、遺伝子内再配列(同じ生物内のあるプラスミドから別のプラスミドへの遺伝子の移動)、および遺伝子の水平移動(HGT、2つの生物間のDNAの移動)は、B. burgdorferiの間で目まぐるしい量の遺伝的不均一性を引き起こしました(例として、Schutzerら⁷を参照)。結果として生じる遺伝子型(または「株」)はすべて同じ種のメンバーですが、異なる哺乳類宿主に伝達し^感染する能力に影響を与える遺伝的差異があります⁸、^9、10、11。このレポートでは、「株」という用語は、特定の自然由来の遺伝的背景を持つB.ブルグドルフェリを指すために使用されます。用語「クローン」は、特定の目的のために、または実験的操作の結果として遺伝子改変された株を指すために使用されるであろう。

B. burgdorferiで使用できる分子ツールボックスには、選択マーカー、遺伝子レポーター、シャトルベクター、トランスポゾン突然変異誘発、誘導性プロモーター、および逆選択マーカーが含まれます(レビューについては、Drektrah and Samuels¹²を参照)。これらの方法論を効果的に使用するには、目的のB.ブルグドルフェリ株に異種(外来)DNAを人工的に導入する必要があります。B. burgdorferiでは、異種DNAの導入は、電気パルスを利用して細菌膜を培地に導入されたDNAの小片に対して一過性に透過させる方法であるエレクトロポレーションによってほぼ独占的に達成される¹。大部分の細胞(≥99.5%と推定)はパルスによって殺されますが、残りの細胞は異種DNAを保持する頻度が高い¹³。細菌にDNAを導入する最も効率的な方法の一つと考えられていますが、B. burgdorferiへのエレクトロポレーションの頻度は非常に低いです(5細胞に1つの形質転換体×10⁴から5×10⁶細胞の範囲)¹³。より高い頻度の変換を達成するための障壁は、技術的および生物学的の両方であるように思われます。B. burgdorferiのエレクトロポレーションを成功させるための技術的障壁には、必要なDNAの量(>10μg)と、エレクトロコンピテントセルを調製する際のスピロヘータが正確に正しい成長段階(中ログ、2×10 7細胞・mL⁻¹と7 × 10⁷細胞・mL⁻¹の間)の両方が含まれます^12,13。ただし、これらの技術的障壁は、生物学的障壁よりも克服しやすい場合があります。

ライム病の研究者は、B.ブルグドルフェリクローンが遺伝的に操作される能力に関して2つの大きなカテゴリーに分けることができることを認識しています^13,14。高継代、実験室適応分離株は、しばしば容易に形質転換されるが、通常は感染力に必須のプラスミドを失い、生理学的に異常な挙動を示し、哺乳類宿主に感染することも、ダニベクター内で持続することもできない^12,13。これらのクローンは、実験室内でスピロヘータの分子生物学的に解剖するのに有用でしたが、風土病サイクルの生物学的文脈の中でスピロヘータを研究するためにはほとんど価値がありません。一方、低継代感染分離株は、感染状態を反映した生理学的に振る舞い、感染サイクルを完了することができますが、通常は異種DNAの導入に難解であるため、研究のために操作することは困難です^12,13。低継代分離株の形質転換の難しさは、少なくとも2つの異なる要因に関連している:(i)低継代分離株は、特にエレクトロポレーションに必要な高密度条件下で、しばしば緊密に凝集し、したがって、多くの細胞が電荷の完全な適用または培地中のDNAへのアクセスのいずれかを遮断する^13,15;(ii)B.ブルグドルフェリは、高継代分離株で失われる可能性のある少なくとも2つの異なるプラスミド媒介制限修飾(R-M)系をコードする^14,16。R-Mシステムは、細菌が外来DNAを認識して排除できるように進化しました¹⁷。実際、B. burgdorferiのいくつかの研究では、DNAのソースが大腸菌ではなくB. burgdorferiである場合に形質転換効率が向上することが示されています^13,16。残念ながら、エレクトロポレーションに必要な高濃度のDNAをB. burgdorferiから取得することは、費用と時間のかかる見通しです。エレクトロポレーションおよび低継代分離株を選択する際の別の潜在的な懸念は、このプロセスが、重要な病原性関連プラスミドlp25^14,18,19を失った形質転換体に有利に働くように見えることです。したがって、エレクトロポレーションを介して低継代B.ブルグドルフェリ単離株を遺伝的に操作する行為そのものが、風土病サイクル²⁰内の生物学的に関連する分析に適さないクローンを選択し得る。これらの問題を考えると、異種DNAを高継代B.ブルグドルフェリクローンに電気変換し、エレクトロポレーション以外の方法で低継代感染分離株に移すことができるシステムは、ライム病スピロヘータで使用できる分子ツールのコレクションの増加に歓迎すべき追加となる可能性があります。

形質転換(裸のDNAの取り込み)に加えて、細菌が異種DNAを定期的に取り込むメカニズムは他に2つあります:互いに直接物理的に接触している細菌間のDNAの交換であるコンジュゲーションと、バクテリオファージによって媒介されるDNAの交換である形質導入²¹。実際、HGTを媒介するバクテリオファージの能力は、多数の細菌系内の分子プロセスを解剖するための実験ツールとして使用されてきた^22、23、24。B. burgdorferiは裸のDNAの取り込みに自然有能ではなく、B. burgdorferiが接合を成功させるために必要な装置をコードしているという証拠はほとんどありません。 しかし、以前の報告では、B. burgdorferi^25,26,27,28の温帯バクテリオファージであるφBB-1の同定と予備的な特性評価が記載されている。φBB-1は、B. burgdorferi²⁵内に見られる30 kbプラスミドのファミリーをパッケージ化します。このファミリーのメンバーはCP32に指定されています。Stevensonらは、B. burgdorferi株間のHGTへの参加におけるφBB-1の役割と一致して、他の点では異なるcp32を持つ2つの株で同一のcp32が見つかったことを報告し、おそらく形質導入を介して、これら2つの株間でこのcp32が最近共有されていることを示唆しています²⁹。また、他の点では比較的安定したゲノム^30,31,32,33の^cp32の間でHGTを介した有意な組換えの証拠もあります。最後に、φBB-1がcp32sおよび異種シャトルベクターDNAの両方を、同じ株の細胞間および2つの異なる株の細胞間で形質導入する能力は、以前に実証されている^27,28。これらの知見から、φBB-1はB. burgdorferiの分子生物学解剖のための別のツールとして提案されている。

このレポートの目的は、 B. burgdorferiからファージφBB-1を誘導および精製する方法を詳述し、 B. burgdorferi クローン間の形質導入アッセイを実行し、潜在的な形質導入物質を選択およびスクリーニングするためのプロトコルを提供することです。