Manipulation génétique médiée par phage du spirochète de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi

Le développement d’outils pour la manipulation génétique de la bactérie spirochétale Borrelia burgdorferi a ajouté une valeur incommensurable à la compréhension de la nature de la maladie de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi possède un génome exceptionnellement complexe composé d’un petit chromosome linéaire et de plasmides linéaires et circulaires ^5,6. La perte plasmidique spontanée, le réarrangement intragénique (mouvement des gènes d’un plasmide à un autre au sein d’un même organisme) et le transfert horizontal de gènes (HGT, le mouvement de l’ADN entre deux organismes) ont donné lieu à une hétérogénéité génétique vertigineuse chez B. burgdorferi (pour un exemple, voir Schutzer et ^al.7). Les génotypes (ou « souches ») qui en résultent sont tous membres de la même espèce, mais présentent des différences génétiques qui influencent leur capacité à transmettre et à infecter différents mammifères hôtes 8,9,10,11. Dans le présent rapport, le terme « souche » sera utilisé pour désigner B. burgdorferi ayant un bagage génétique naturel particulier; Le terme « clone » sera utilisé pour désigner une souche qui a été génétiquement modifiée dans un but particulier ou à la suite d’une manipulation expérimentale.

La boîte à outils moléculaire disponible pour une utilisation chez B. burgdorferi comprend des marqueurs sélectionnables, des rapporteurs de gènes, des vecteurs navettes, une mutagénèse par transposon, des promoteurs inductibles et des marqueurs contre-sélectionnables (pour une revue, voir Drektrah et Samuels¹²). L’utilisation efficace de ces méthodologies nécessite l’introduction artificielle d’ADN hétérologue (étranger) dans une souche d’intérêt de B. burgdorferi. Chez B. burgdorferi, l’introduction de l’ADN hétérologue est réalisée presque exclusivement par électroporation, une méthode qui utilise une impulsion électrique pour rendre une membrane bactérienne transitoirement perméable à de petits morceaux d’ADN introduits dans le milieu¹. La majorité des cellules (estimées à ≥99,5%) sont tuées par le pouls, mais les cellules restantes ont une fréquence élevée de rétention de l’ADN hétérologue¹³. Bien que considérée comme l’une des méthodes les plus efficaces pour introduire de l’ADN dans les bactéries, la fréquence d’électroporation dans B. burgdorferi est très faible (allant de 1 transformant sur 5 × 10⁴ à 5 × 10⁶ cellules)¹³. Les obstacles à l’obtention de fréquences de transformation plus élevées semblent être à la fois techniques et biologiques. Les obstacles techniques à une électroporation réussie de B. burgdorferi comprennent à la fois la quantité d’ADN (>10 μg) nécessaire et l’exigence que les spirochètes soient exactement dans la phase de croissance correcte (log moyen, entre 2 × 10 7 cellules·mL−1 et 7 × 10⁷ cellules·mL⁻¹) lors de la préparation de cellules électrocompétentes^12,13. Ces obstacles techniques, cependant, peuvent être plus faciles à surmonter que les obstacles biologiques.

Les chercheurs sur la maladie de Lyme reconnaissent que les clones de B. burgdorferi peuvent être divisés en deux grandes catégories en ce qui concerne leur capacité à être manipulés génétiquement^13,14. Les isolats à passage élevé adaptés au laboratoire sont souvent facilement transformés, mais ont généralement perdu les plasmides essentiels à l’infectiosité, se comportent de manière physiologiquement aberrante et ne sont pas capables d’infecter un hôte mammifère ou de persister dans un vecteur^{de tiques 12,13}. Bien que ces clones aient été utiles pour disséquer la biologie moléculaire du spirochète en laboratoire, ils sont de peu de valeur pour étudier le spirochète dans le contexte biologique du cycle enzootique. Les isolats infectieux à faible passage, en revanche, se comportent d’une manière physiologique reflétant un état infectieux et peuvent compléter le cycle infectieux, mais sont généralement récalcitrants à l’introduction d’ADN hétérologue et sont, par conséquent, difficiles à manipuler pour l’étude^12,13. La difficulté de transformer les isolats à faible passage est liée à au moins deux facteurs différents : (i) les isolats à faible passage s’agglutinent souvent étroitement, en particulier dans les conditions de haute densité requises pour l’électroporation, empêchant ainsi de nombreuses cellules d’appliquer pleinement la charge électrique ou d’accéder à l’ADN dans le milieu^13,15; et ii) B. burgdorferi code pour au moins deux systèmes différents de restriction-modification (R-M) transmis par plasmide qui peuvent être perdus dans les isolats à passage élevé^14,16. Les systèmes R-M ont évolué pour permettre aux bactéries de reconnaître et d’éliminer l’ADN étranger¹⁷. En effet, plusieurs études sur B. burgdorferi ont démontré que l’efficacité de la transformation augmente lorsque la source de l’ADN est B. burgdorferi plutôt qu’Escherichia coli^13,16. Malheureusement, l’acquisition de la concentration élevée requise d’ADN pour l’électroporation de B. burgdorferi est une perspective coûteuse et chronophage. Une autre préoccupation potentielle lors de l’électroporation et de la sélection d’isolats à faible passage est que le processus semble favoriser les transformants qui ont perdu le plasmide critique associé à la virulence, lp25^14,18,19; ainsi, l’acte même de manipuler génétiquement des isolats de B. burgdorferi à faible passage par électroporation peut sélectionner des clones qui ne conviennent pas à une analyse biologiquement pertinente dans le cycle enzootique²⁰. Compte tenu de ces problèmes, un système dans lequel l’ADN hétérologue pourrait être électrotransformé en clones de B. burgdorferi à passage élevé, puis transféré dans des isolats infectieux à faible passage par une méthode autre que l’électroporation pourrait être un ajout bienvenu à la collection croissante d’outils moléculaires disponibles pour une utilisation dans le spirochète de la maladie de Lyme.

En plus de la transformation (l’absorption de l’ADN nu), il existe deux autres mécanismes par lesquels les bactéries absorbent régulièrement l’ADN hétérologue : la conjugaison, qui est l’échange d’ADN entre bactéries en contact physique direct les unes avec les autres, et la transduction, qui est l’échange d’ADN médié par un bactériophage²¹. En effet, la capacité du bactériophage à médier HGT a été utilisée comme outil expérimental pour disséquer les processus moléculaires dans un certain nombre de systèmes bactériens^22,23,24. B. burgdorferi n’est pas naturellement compétent pour l’absorption de l’ADN nu, et il y a peu de preuves que B. burgdorferi code l’appareil nécessaire pour favoriser une conjugaison réussie. Des rapports antérieurs ont décrit, cependant, l’identification et la caractérisation préliminaire de φBB-1, un bactériophage tempéré de B. burgdorferi^25,26,27,28. φBB-1 regroupe une famille de plasmides de 30 kb trouvés dans B. burgdorferi²⁵; Les membres de cette famille ont été désignés CP32. Conformément au rôle de φBB-1 dans la participation au HGT parmi les souches de B. burgdorferi, Stevenson et al. ont rapporté un cp32 identique trouvé dans deux souches avec des cp32 autrement disparates, suggérant un partage récent de ce cp32 entre ces deux souches, probablement par transduction²⁹. Il existe également des preuves d’une recombinaison significative via HGT parmi les cp32 dans un génome 30,31,32,33 par ailleurs relativement stable. Enfin, la capacité de φBB-1 à transduire à la fois cp32s et l’ADN vectoriel navette hétérologue entre cellules de la même souche et entre cellules de deux souches différentes a été démontrée précédemment^27,28. Compte tenu de ces résultats, φBB-1 a été proposé comme un autre outil à développer pour la dissection de la biologie moléculaire de B. burgdorferi.

L’objectif de ce rapport est de détailler une méthode pour induire et purifier le phage φBB-1 de B. burgdorferi, ainsi que de fournir un protocole pour effectuer un test de transduction entre clones de B. burgdorferi et sélectionner et cribler des transducteurs potentiels.