Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Spiroketal bakteri Borrelia burgdorferi’nin genetik manipülasyonu için araçların geliştirilmesi, Lyme^{hastalığının 1,2,3,4} doğasının anlaşılmasına ölçülemez bir değer katmıştır. B. burgdorferi, küçük bir doğrusal kromozomdan ve hem doğrusal hem de dairesel plazmidlerden oluşan alışılmadık derecede karmaşık bir genoma sahiptir ^5,6. Spontan plazmid kaybı, intragenik yeniden düzenleme (aynı organizma içinde genlerin bir plazmidden diğerine hareketi) ve yatay gen transferi (HGT, DNA’nın iki organizma arasındaki hareketi), B. burgdorferi arasında baş döndürücü miktarda genetik heterojenliğe yol açmıştır (örneğin, Schutzer ve ^ark.7’ye bakınız). Ortaya çıkan genotipler (veya “suşlar”) aynı türün üyeleridir, ancak farklı memeli konakçılarına bulaşma ve enfekte etme yeteneklerini etkileyen genetik farklılıklara sahiptir ^8,9,10,11. Bu raporda, “suş” terimi, doğal olarak türetilmiş belirli bir genetik geçmişe sahip B. burgdorferi’ye atıfta bulunmak için kullanılacaktır; “klon” terimi, belirli bir amaç için veya deneysel manipülasyonun bir sonucu olarak genetik olarak değiştirilmiş bir suşu ifade etmek için kullanılacaktır.

B. burgdorferi’de kullanılabilen moleküler araç kutusu, seçilebilir belirteçleri, gen muhabirlerini, mekik vektörlerini, transpozon mutagenezini, indüklenebilir promotörleri ve karşı seçilebilir belirteçleri içerir (bir inceleme için bkz. Drektrah ve Samuels¹²). Bu metodolojilerin etkili kullanımı, heterolog (yabancı) DNA’nın ilgilenilen bir B. burgdorferi suşuna yapay olarak sokulmasını gerektirir. B. burgdorferi’de, heterolog DNA’nın tanıtılması neredeyse tamamen elektroporasyon yoluyla elde edilir; bu, bir bakteri zarını ortama sokulan küçük DNA parçalarına geçici olarak geçirgen hale getirmek için bir elektrik darbesi kullanan bir yöntemdir¹. Hücrelerin çoğunluğu (≥% 99.5) olduğu tahmin edilmektedir, ancak kalan hücreler heterolog DNA^13’ü tutma sıklığı yüksektir. DNA’yı bakterilere sokmanın en etkili yöntemlerinden biri olarak kabul edilmesine rağmen, B. burgdorferi’ye elektroporasyon sıklığı çok düşüktür (5 × 10⁴ ila 5 × 10⁶ hücrede 1 dönüştürücü arasında değişmektedir)¹³. Daha yüksek dönüşüm frekanslarına ulaşmanın önündeki engeller hem teknik hem de biyolojik gibi görünmektedir. B. burgdorferi’nin başarılı elektroporasyonunun önündeki teknik engeller, elektroremetuar hücreleri hazırlarken hem gerekli olan DNA miktarını (>10 μg) hem de spiroketlerin tam olarak doğru büyüme aşamasında (orta log, 2 ila 10 7 hücre · mL-1 ve⁷ ×× 10⁷ hücre · mL ^{− 1}) olma gereksinimini içerir^12,13. Bununla birlikte, bu teknik engellerin üstesinden gelmek biyolojik engellerden daha kolay olabilir.

Lyme hastalığı araştırmacıları, B. burgdorferi klonlarının genetik olarak manipüle edilme yetenekleri açısından iki geniş kategoriye ayrılabileceğini kabul etmektedir^13,14. Yüksek pasajlı, laboratuara uyarlanmış izolatlar genellikle kolayca dönüştürülür, ancak genellikle bulaşıcılık için gerekli olan plazmidleri kaybetmiş, fizyolojik olarak anormal bir şekilde davranmış ve bir memeli konağını enfekte edememiş veya bir kene vektörü^12,13 içinde devam edememiştir. Bu klonlar, spiroketin moleküler biyolojisini laboratuarda incelemek için yararlı olsa da, spiroketi enzootik döngünün biyolojik bağlamında incelemek için çok az değere sahiptir. Öte yandan, düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlar, enfeksiyöz bir durumu yansıtan fizyolojik bir şekilde davranırlar ve enfeksiyöz döngüyü tamamlayabilirler, ancak genellikle heterolog ^DNA’nın girişine inatçıdır ve bu nedenle, çalışma^12,13 için manipüle edilmesi zordur. Düşük pasajlı izolatların dönüştürülmesindeki zorluk, en az iki farklı faktörle ilgilidir: (i) düşük pasajlı izolatlar, özellikle elektroporasyon için gerekli olan yüksek yoğunluklu koşullar altında, genellikle sıkıca bir araya toplanır, böylece birçok hücrenin elektrik yükünün tam olarak uygulanmasını veya ortamdaki DNA’ya erişimini engeller^13,15; ve (ii) B. burgdorferi, yüksek pasajlı izolatlarda kaybolabilecek en az iki farklı plazmid kaynaklı kısıtlama-modifikasyon (R-M) sistemini kodlar^14,16. R-M sistemleri, bakterilerin yabancı DNA’yı tanımasına ve ortadan kaldırmasına izin verecek şekilde evrimleşmiştir¹⁷. Gerçekten de, B. burgdorferi’de yapılan birkaç çalışma, DNA’nın kaynağı Escherichia coli^13,16 yerine B. burgdorferi olduğunda dönüşüm verimliliğinin arttığını göstermiştir. Ne yazık ki, B. burgdorferi’den elektroporasyon için gerekli yüksek konsantrasyonda DNA elde etmek pahalı ve zaman alıcı bir olasılıktır. Düşük pasajlı izolatların elektroporasyonu ve seçilmesi sırasında bir diğer potansiyel endişe, işlemin kritik virülansla ilişkili plazmidi kaybetmiş transformantları tercih ediyor gibi görünmesidir, lp25^14,18,19; Bu nedenle, düşük pasajlı B. burgdorferi izolatlarını elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme eylemi, enzootik döngü²⁰ içinde biyolojik olarak ilgili analizler için uygun olmayan klonları seçebilir. Bu sorunlar göz önüne alındığında, heterolog DNA’nın yüksek pasajlı B. burgdorferi klonlarına elektrotransforme edilebileceği ve daha sonra elektroporasyon dışında bir yöntemle düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlara aktarılabileceği bir sistem, Lyme hastalığı spiroketinde kullanılmak üzere mevcut moleküler araçların artan koleksiyonuna hoş bir katkı olabilir.

Transformasyona (çıplak DNA’nın alımı) ek olarak, bakterilerin düzenli olarak heterolog DNA’yı aldıkları iki mekanizma daha vardır: birbirleriyle doğrudan fiziksel temas halinde olan bakteriler arasındaki DNA değişimi olan konjugasyon ve bir bakteriyofaj²¹ tarafından aracılık edilen DNA değişimi olan transdüksiyon. Gerçekten de, bakteriyofajın HGT’ye aracılık etme yeteneği, bir dizi bakteri sistemi içindeki moleküler süreçleri incelemek için deneysel bir araç olarak kullanılmıştır^22,23,24. B. burgdorferi, çıplak DNA’nın alımı için doğal olarak yetkin değildir ve B. burgdorferi’nin başarılı konjugasyonu teşvik etmek için gerekli aparatı kodladığına dair çok az kanıt vardır. Bununla birlikte, önceki raporlar, B. burgdorferi^{25,26,27,28’in} ılıman bir bakteriyofajı olan φBB-1’in tanımlanmasını ve ön karakterizasyonunu tanımlamıştır. φBB-1, B. burgdorferi^25’te bulunan 30 kb’lik bir plazmid ailesini paketler; bu ailenin üyeleri cp32s olarak belirlenmiştir. B. burgdorferi suşları arasında HGT’ye katılmada φBB-1’in rolüyle tutarlı olarak, Stevenson ve ark., aksi takdirde farklı cp32’lere sahip iki suşta bulunan özdeş bir cp32 bildirmiştir, bu da bu cp32’nin bu iki suş arasında, muhtemelen transdüksiyon²⁹ yoluyla yakın zamanda paylaşıldığını düşündürmektedir. Ayrıca, aksi takdirde nispeten kararlı bir genom 30,31,32,33’te ^cp32’ler arasında HGT yoluyla önemli rekombinasyon kanıtı ^vardır. Son olarak, φBB-1’in hem cp32’leri hem de heterolog mekik vektör DNA’sını aynı suşun hücreleri arasında ve iki farklı suşun hücreleri arasında dönüştürme kabiliyeti daha önce^27,28 gösterilmiştir. Bu bulgular göz önüne alındığında, φBB-1, B. burgdorferi’nin moleküler biyolojisinin diseksiyonu için geliştirilecek başka bir araç olarak önerilmiştir.

Bu raporun amacı, B. burgdorferi’den faj φBB-1’i indüklemek ve saflaştırmak için bir yöntemi detaylandırmak, ayrıca B. burgdorferi klonları arasında bir transdüksiyon testi yapmak ve potansiyel transdüktörleri seçmek ve taramak için bir protokol sağlamaktır.