Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Le caspasi sono una famiglia di proteasi aspartato di cisteina che possono essere raggruppate in caspasi iniziatrici e caspasi boia. Le caspasi del boia comprendono caspasi-3, -6 e -7. Si trovano naturalmente nelle cellule come dimeri e vengono scissi dalle caspasi iniziatrici per eseguire l’apoptosi¹. Le caspasi iniziatrici includono caspasi umane-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Si trovano come zimogeni inattivi (pro-caspasi) che vengono attivati dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità e stabilizzati dalla scissione autoproteolitica ^2,3. Le caspasi infiammatorie sono un sottoinsieme delle caspasi iniziatrici² e comprendono caspasi-1, -4, -5 e -12 negli esseri umani e caspasi-1, -11 e -12 nel topo ^4,5. Piuttosto che un ruolo apoptotico, svolgono un ruolo centrale nell’infiammazione. Mediano l’elaborazione proteolitica e la secrezione di pro-interleuchina (IL)-1β e pro-IL-18 ^6,7, che sono le prime citochine ad essere rilasciate in risposta agli invasori patogeni ^8,9. Caspase-1 viene attivato al momento del reclutamento sulla sua piattaforma di attivazione; un grande complesso proteico a peso molecolare chiamato inflammasoma (Figura 1A)¹⁰. La dimerizzazione della caspasi-4, -5 e -11 avviene indipendentemente da queste piattaforme attraverso una via infiammatoria non canonica^11,12.

Gli inflammasomi canonici sono complessi proteici multimerici citosolici costituiti da una proteina sensore inflammasoma, la proteina adattatrice ASC (proteina simile allo speck associata all’apoptosi contenente una CARD) e la proteina effettrice caspasi-1¹⁰. Gli inflammasomi canonici più studiati sono la famiglia di recettori NOD-like contenente un dominio pirinico (NLRP), NLRP1 e NLRP3, la famiglia NLR contenente un CARD (NLRC), NLRC4 e l’assente nel melanoma 2 (AIM2). Ognuno di essi contiene un dominio pyrin, una CARD o entrambi i domini. Il dominio CARD media l’interazione tra le caspasi contenenti CARD e i loro attivatori a monte. Pertanto, la molecola di impalcatura ASC, che è composta da un dominio di pirina N-terminale (PYD) e un motivo CARD C-terminale ^13,14, è necessaria per il reclutamento di caspasi-1 agli inflammasomi ^{NLRP1 10}, NLRP3¹⁵ e AIM2¹⁶.

Ogni inflammasoma prende il nome dalla sua unica proteina sensore che riconosce distinti stimoli pro-infiammatori (Figura 1B). Gli attivatori di questo percorso sono chiamati stimoli canonici. Gli inflammasomi fungono da sensori per i componenti microbici e lo stress tissutale e si assemblano per innescare una robusta risposta infiammatoria attraverso l’attivazione delle caspasi infiammatorie¹⁷. L’assemblaggio dell’inflammasoma avvia l’attivazione della caspasi-1 per mediare la maturazione e la secrezione dei suoi principali substrati pro-IL-1β e pro-IL-18. Questo processo avviene tramite un meccanismo in due fasi. In primo luogo, uno stimolo primordiale sovraregola l’espressione di alcune proteine inflammasoma e pro-IL-1β attraverso l’attivazione della via NF-κB. In secondo luogo, uno stimolo intracellulare (canonico) induce l’assemblaggio dell’inflammasoma e il reclutamento della procaspasi-1 ^6,7.

Caspase-4 e caspasi-5 sono gli ortologhi umani della caspasi murina-11¹¹. Sono attivati in modo indipendente dall’inflammasoma dal lipopolisaccaride intracellulare (LPS), una molecola presente nella membrana esterna dei batteri Gram-negativi ^18,19,20, e dall’eme extracellulare, un prodotto dell’emolisi dei globuli rossi²¹. È stato proposto che LPS si leghi direttamente al motivo CARD di queste proteine e induca la loro oligomerizzazione²⁰. L’attivazione della caspasi-4 o della caspasi-5 promuove il rilascio di IL-1β inducendo una forma infiammatoria di morte cellulare chiamata piroptosi attraverso la scissione della proteina gasdermina D (GSDMD)^18,19. Inoltre, l’efflusso di ioni potassio derivanti dalla morte piroptotica mediata da caspasi-4 e GSDMD induce l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 e la successiva attivazione della caspasi-1^22,23. Pertanto, caspasi-4, -5 e -11 sono considerati sensori intracellulari per LPS che sono in grado di indurre l’attivazione della piroptosi e della caspasi-1 in risposta a stimoli specifici^11,24.

Figura 1: Caspasi infiammatorie e test della complementazione di fluorescenza caspasi-bimolecolare (BiFC). (A) Diagramma che mostra il sistema caspasi-BiFC, in cui due prodomini caspasi-1 (C1-pro) legati a ciascun frammento non fluorescente di Venere (Venere-C o Venere-N) vengono reclutati nella piattaforma di attivazione NLRP3, costringendo Venere a ripiegarsi e fluorescere. Questo complesso appare come una macchia verde al microscopio e funge da lettura per la prossimità indotta da caspasi infiammatoria, che è il primo passo nell’attivazione della caspasi iniziatrice. (B) Schema che mostra l’organizzazione del dominio dei componenti inflammasoma e delle caspasi infiammatorie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Misurare l’attivazione di caspasi iniziatrici specifiche è difficile e non ci sono molti metodi disponibili per farlo con approcci di imaging. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) può essere utilizzato per visualizzare l’attivazione della caspasi infiammatoria direttamente nelle cellule viventi (Figura 1A)²⁵. Questa tecnica è stata recentemente adattata per l’uso in macrofagi derivati da monociti umani (MDM)²¹. Caspasi BiFC misura il primo passo nell’attivazione della caspasi infiammatoria, la vicinanza indotta per facilitare la dimerizzazione. Viene utilizzata l’espressione di plasmidi che codificano il prodominio caspasi contenente CARD fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla fotostabile Venere (Venus-C [VC]) e Venere-N [VN]). Quando i due prodomini della caspasi vengono reclutati sulla loro piattaforma di attivazione o subiscono una vicinanza indotta, le due metà di Venere vengono portate in prossimità e costrette a ripiegarsi e fluorescere (vedi Figura 1A,B). Ciò fornisce una lettura in tempo reale dell’attivazione di caspasi infiammatorie specifiche.

L’MDM umano esprime abbondantemente geni inflammasoma e recettori di riconoscimento dei modelli che identificano segnali di pericolo e prodotti patogeni. Ciò fornisce un tipo di cellula ideale per l’interrogazione delle vie infiammatorie della caspasi. Inoltre, possono essere derivati dal sangue periferico e persino da campioni di pazienti per valutare l’attivazione della caspasi infiammatoria in uno specifico stato patologico. Questo protocollo descrive come introdurre i reporter della caspasi BiFC nell’MDM usando la nucleofezione, un metodo di trasfezione basato sull’elettroporazione, come trattare le cellule per indurre l’attivazione della caspasi infiammatoria e come visualizzare i complessi di caspasi attivi utilizzando approcci microscopici. Inoltre, questa metodologia può essere adattata per determinare la composizione molecolare di questi complessi, la localizzazione subcellulare, la cinetica e le dimensioni di queste strutture altamente ordinate 25,26,27.