تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية
Summary
يصف هذا البروتوكول سير العمل للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM) من عينات الدم البشرية ، وهي طريقة بسيطة لإدخال مراسلي تكملة الفلور ثنائي الجزيئية (BiFC) بكفاءة إلى MDM البشري دون المساس بصلاحية الخلايا وسلوكها ، ونهج قائم على التصوير لقياس تنشيط كاسباز الالتهابي في الخلايا الحية.
Abstract
تشمل الكاسباس الالتهابية كاسباز-1 و-4 و-5 و-11 و-12 وتنتمي إلى المجموعة الفرعية من كاسباس البادئ. مطلوب Caspase-1 لضمان التنظيم الصحيح للإشارات الالتهابية ويتم تنشيطه عن طريق التثبيط الناجم عن القرب بعد التجنيد للالتهابات. Caspase-1 وفير في سلالة الخلايا الأحادية ويحفز نضج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات interleukin (IL)-1β و IL-18 إلى جزيئات إفرازية نشطة. الكاسباس الالتهابي الآخر ، caspase-4 و -5 (و caspase-11 المتجانسة الفئران) تعزز إطلاق IL-1β عن طريق تحفيز pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) هي أداة تستخدم لقياس القرب الناجم عن كاسباز الالتهابي كقراءة لتنشيط كاسباز. يندمج المجال الكاسبازي-1 أو -4 أو -5 ، الذي يحتوي على المنطقة التي ترتبط بالالتهاب ، مع شظايا غير فلورية من بروتين الفلورسنت الأصفر فينوس (Venus-N [VN] أو Venus-C [VC]) التي ترتبط بإصلاح مجمع الزهرة الفلوري عندما تخضع الكاسباس للقرب المستحث. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال هؤلاء المراسلين في البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM) البشرية باستخدام النيوكليوفيكتيون ، وعلاج الخلايا للحث على تنشيط كاسباز الالتهابي ، وقياس تنشيط كاسباز باستخدام التألق والمجهر البؤري. ميزة هذا النهج هي أنه يمكن استخدامه لتحديد المكونات والمتطلبات وتوطين مجمع تنشيط كاسباز الالتهابي في الخلايا الحية. ومع ذلك ، يجب النظر في ضوابط دقيقة لتجنب المساس ببقاء الخلايا وسلوكها. هذه التقنية هي أداة قوية لتحليل تفاعلات كاسباز الديناميكية على مستوى الالتهاب وكذلك لاستجواب شلالات الإشارات الالتهابية في MDM الحية والخلايا الوحيدة المشتقة من عينات الدم البشرية.
Introduction
ال caspases هي عائلة من بروتياز الأسبارتات السيستين التي يمكن تجميعها في كاسباس البادئ وكاسباس الجلاد. تتكون كاسباس الجلاد من كاسباز-3 و-6 و-7. توجد بشكل طبيعي في الخلايا على شكل دايمرات ويتم شقها بواسطة كاسباس البادئ لتنفيذ موت الخلايا المبرمج1. تشمل كاسباس المبادر كاسباز الإنسان -1 و -2 و -4 و -5 و -8 و -9 و -10 و -12. تم العثور عليها على أنها zymogens غير نشطة (pro-caspases) التي يتم تنشيطها عن طريق dimerization الناجم عن القرب وتثبيتها بواسطة الانقسام الذاتي للتحلل البروتيني 2,3. الكاسباس الالتهابي هو مجموعة فرعية من كاسباس البادئ 2 ويشمل كاسباز-1 و -4 و–5 و -12 في البشر ، و كاسباز-1 و -11 و -12 في الفأر 4,5. بدلا من دور الاستماتة ، فإنها تلعب دورا مركزيا في الالتهاب. إنها تتوسط في المعالجة البروتينية وإفراز pro-interleukin (IL)-1β و pro-IL-18 6,7 ، والتي تعد أول سيتوكينات يتم إطلاقها استجابة للغزاة المسببين للأمراض 8,9. يتم تنشيط Caspase-1 عند التوظيف في منصة التنشيط الخاصة به ؛ مركب بروتيني كبير الوزن الجزيئي يسمى الالتهاب (الشكل 1A)10. يحدث تعتيم كاسباز-4 و-5 و-11 بشكل مستقل عن هذه المنصات من خلال مسار التهابي غير قانوني11,12.
الالتهابات القانونية هي مجمعات بروتين متعددة الكريات الخلوية تتكون من بروتين استشعار ملتهب ، وبروتين محول ASC (بروتين يشبه البقع المرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD) ، والبروتين المستجيب caspase-110. أكثر الالتهابات القانونية دراسة جيدة هي عائلة المستقبلات الشبيهة ب NOD التي تحتوي على مجال البيرين (NLRP) و NLRP1 و NLRP3 ، وعائلة NLR التي تحتوي على CARD (NLRC) ، NLRC4 ، والغائبة في سرطان الجلد 2 (AIM2). يحتوي كل منها على مجال pyrin أو CARD أو كلا المجالين. يتوسط نطاق CARD التفاعل بين caspases المحتوية على CARD ومنشطات المنبع الخاصة بها. لذلك ، فإن جزيء السقالة ASC ، الذي يتكون من مجال pyrin N-terminal (PYD) وزخارف C-terminal CARD 13,14 ، مطلوب لتوظيف caspase-1 إلى NLRP110 و NLRP315 و AIM216 الالتهابات.
سمي كل ملتهب على اسم بروتين الاستشعار الفريد الذي يتعرف على المحفزات المؤيدة للالتهابات المتميزة (الشكل 1B). يطلق على منشطات هذا المسار المحفزات الأساسية. تعمل الالتهابات كأجهزة استشعار للمكونات الميكروبية وإجهاد الأنسجة ، وتتجمع لتحفيز استجابة التهابية قوية من خلال تنشيط الشذرات الالتهابية17. يبدأ تجميع Inflammasome تنشيط caspase-1 للتوسط في نضج وإفراز ركائزه الرئيسية المؤيدة ل IL-1β و pro-IL-18. تحدث هذه العملية عبر آلية من خطوتين. أولا ، ينظم الحافز التحضيري التعبير عن بعض البروتينات الالتهابية و pro-IL-1β من خلال تنشيط مسار NF-κB. ثانيا ، يحفز الحافز داخل الخلايا (الأساسي) على تجميع الالتهابات وتجنيد procaspase-1 6,7.
Caspase-4 و caspase-5 هي تقويم العظام البشري ل murine caspase-1111. يتم تنشيطها بطريقة مستقلة عن الالتهابات بواسطة عديد السكاريد الشحمي داخل الخلايا (LPS) ، وهو جزيء موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام18،19،20 ، وبواسطة الهيم خارج الخلية ، وهو نتاج انحلال الدم في خلايا الدم الحمراء 21. وقد اقترح أن LPS يرتبط مباشرة بفكرة CARD لهذه البروتينات ويحفز قلة القلة20. تنشيط caspase-4 أو caspase-5 يعزز إطلاق IL-1β عن طريق تحفيز شكل التهابي من موت الخلايا يسمى pyroptosis من خلال انقسام البروتين المكون للمسام gasdermin D (GSDMD) 18,19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تدفق أيونات البوتاسيوم الناتجة عن كاسباز-4 والموت الحراري بوساطة GSDMD يحفز تنشيط الالتهاب NLRP3 والتنشيط اللاحق ل caspase-122,23. لذلك ، تعتبر caspase-4 و -5 و -11 أجهزة استشعار داخل الخلايا ل LPS قادرة على تحفيز pyroptosis وتنشيط caspase-1 استجابة لمحفزات محددة11,24.
الشكل 1: كاسباس التهابي واختبار تكملة التألق ثنائي الجزيئية (BiFC) (A) رسم بياني يوضح نظام caspase-BiFC ، حيث يتم تجنيد اثنين من prodomains caspase-1 (C1-pro) مرتبطين بكل جزء غير فلورسنت من Venus (Venus-C أو Venus-N) إلى منصة تنشيط NLRP3 ، مما يجبر كوكب الزهرة على الارتداد والفلوريس. يظهر هذا المركب كبقعة خضراء تحت المجهر ويعمل كقراءة للقرب الناجم عن كاسباز الالتهابي ، وهي الخطوة الأولى في تنشيط كاسباز البادئ. (ب) مخطط يوضح تنظيم المجال للمكونات الالتهابية والكباسات الالتهابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من الصعب قياس تنشيط كاسباس البادئ المحدد ، ولا توجد العديد من الطرق المتاحة للقيام بذلك عن طريق أساليب التصوير. يمكن استخدام تكملة التألق ثنائي الجزيئية Caspase (BiFC) لتصور تنشيط كاسباز الالتهابي مباشرة في الخلايا الحية (الشكل 1A)25. وقد تم تكييف هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM)21. يقيس Caspase BiFC الخطوة الأولى في تنشيط كاسباز الالتهابي ، القرب الناجم عن تسهيل التعتيم. يتم استخدام التعبير عن البلازميدات التي تشفر المجال الكاسبازي المحتوي على بطاقة والذي يندمج في شظايا غير فلورسنتية من البروتين الفلوري الأصفر القابل للتصوير Venus (Venus-C [VC]) و Venus-N [VN]). عندما يتم تجنيد اثنين من prodomains caspase إلى منصة التنشيط الخاصة بهم أو الخضوع للقرب المستحث ، يتم جلب نصفي كوكب الزهرة على مقربة وإجبارهم على الارتداد والفلوريس (انظر الشكل 1A ، B). هذا يوفر قراءة في الوقت الحقيقي لتنشيط كاسباز التهابي محدد.
يعبر MDM البشري بكثرة عن الجينات الالتهابية ومستقبلات التعرف على الأنماط التي تحدد إشارات الخطر ومنتجات مسببات الأمراض. وهذا يوفر نوعا مثاليا من الخلايا لاستجواب مسارات كاسباز الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اشتقاقها من الدم المحيطي وحتى من عينات المرضى لتقييم تنشيط كاسباز الالتهابي في حالة مرضية معينة. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مراسلي كاسباز BiFC إلى MDM باستخدام nucleofection ، وهي طريقة نقل قائمة على الكهربية ، وكيفية علاج الخلايا للحث على تنشيط كاسباز التهابي ، وكيفية تصور مجمعات كاسباز النشطة باستخدام أساليب الفحص المجهري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذه المنهجية لتحديد التركيب الجزيئي لهذه المجمعات ، والتوطين تحت الخلوي ، والحركيات ، وحجم هذه الهياكل عالية الترتيب25،26،27.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول سير العمل للحصول على البلاعم من الخلايا الوحيدة المعزولة من عينات الدم البشرية وطريقة لإدخال مراسلي الكاسباز الالتهابي BiFC بكفاءة في MDM البشري دون المساس بصلاحية الخلايا وسلوكها.
يستفيد هذا البروتوكول من تقنية BiFC35 لوضع علامة على الكاسباس ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر LBH السابقين والحاليين الذين ساهموا في تطوير هذه التقنية. يتم دعم هذا المختبر من قبل NIH / NIDDK T32DK060445 (BEB) ، NIH / NIDDK F32DK121479 (BEB) ، NIH / NIGMS R01GM121389 (LBH). تم رسم الشكل 2 باستخدام برنامج Bionder.
Materials
| 48 well tissue culture2:34 plates | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm Tissue Culture Dishes | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS columns | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMACS Rinsing Solution | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | For automated separation using AutoMACS Pro Separator only |
| AutoMacs running buffer | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit | Zeiss | Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope | Zeiss | Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator |
| DPBS without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, from Porcine, ≥96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | Available by request from LBH lab | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS Columns | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS 15 mL Tube Rack | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| mCherry plasmid | Yungpeng Wang Lab | Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 µL Neon tips and Neon electroporation tubes |
| Nigericin sodium salt, ready made solution | Sigma | SML1779-1ML | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | For manual separation using QuadroMACS Separator only |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software | Zeiss | Any software used to operate the confocal microscope of choice |
Referencias
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Boice, A., Bouchier-Hayes, L. Targeting apoptotic caspases in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).
- Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease. The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).
- Martinon, F., Tschopp, J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117 (5), 561-574 (2004).
- Lamkanfi, M., Vishva, M. D. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).
- Viganò, E., et al. Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes. Nature Communications. 6, 8761 (2015).
- Cerretti, D. P., et al. Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256 (5053), 97 (1992).
- van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection. Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).
- Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Bertin, J., DiStefano, P. S. The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins. Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).
- Agostini, L., et al. NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder. Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).
- Bürckstümmer, T., et al. An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome. Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. Activation and regulation of the inflammasomes. Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
- Bolívar, B. E., et al. Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death. The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).
- Schmid-Burgk, J. L., et al. Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells. European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).
- Baker, P. J., et al. NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5. European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).
- Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis. Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death & Disease. 6, 1813 (2015).
- Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).
- Perregaux, D., et al. IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin. The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).
- Cheneval, D., et al. Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing. Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).
- Fernandes-Alnemri, T., et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).
- Lu, A., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases. Blood. 32 (5), 811-815 (1968).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Thornberry, N. A., et al. A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
- Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation. Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).
- Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).
- Bhowmik, P., et al. Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).
- Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).
- Kurokawa, M., Kornbluth, S. Caspases and kinases in a death grip. Cell. 138 (5), 838-854 (2009).
