Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

As caspases são uma família de proteases de cisteína aspartate que podem ser agrupadas em caspases iniciadores e caspases carrascos. As caspases carrascos compreendem caspase-3, -6 e -7. Eles são naturalmente encontrados em células como dimers e são cortados pelas caspases iniciadores para executar apoptose¹. As caspases iniciais incluem caspase humana-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Eles são encontrados como zymogens inativos (pro-caspases) que são ativados pela dimerização induzida pela proximidade e estabilizados pelo decote auto-proteolítico ^2,3. As caspases inflamatórias são um subconjunto das caspases^{iniciadores 2} e englobam caspase-1, -4, -5 e -12 em humanos, e caspase-1, -11 e -12 no rato ^4,5. Em vez de um papel apoptótico, eles desempenham um papel central na inflamação. Eles mediam o processamento proteolítico e a secreção de pró-interleucina (IL)-1β e pró-IL-18 ^6,7, que são os primeiros citocinas a serem liberados em resposta aos invasores patogênicos ^8,9. O Caspase-1 é ativado após o recrutamento para sua plataforma de ativação; um grande complexo de proteína de peso molecular denominado inflamado (Figura 1A)¹⁰. A dimerização da caspase-4, -5 e -11 ocorre independentemente dessas plataformas através de uma via inflamamsome nãocanônica^11,12.

Os inflamamossscópios canônicos são complexos de proteína multimédica citosolic que consistem em uma proteína sensormasome inflamada, a proteína adaptadora ASC (proteína associada à apoptose contendo um CARD), e o caspase de proteína effectora-1¹⁰. Os inflamatórios canônicos mais bem estudados são a família receptora semelhante ao NOD contendo um domínio de pirina (NLRP), NLRP1 e NLRP3, a família NLR contendo um CARD (NLRC), NLRC4, e a ausência no melanoma 2 (AIM2). Cada um deles contém um domínio pirin, um CARD ou ambos os domínios. O domínio CARD media a interação entre as caixas contendo cartão e seus ativadores upstream. Portanto, a molécula de andaime ASC, que é composta por um domínio de pirina n-terminal (PYD) e um motivo de CARD terminal C^13,14, é necessária para o recrutamento de caspase-1 para o NLRP1¹⁰, NLRP3¹⁵ e AIM2¹⁶ inflamações.

Cada inflamatório é nomeado após sua proteína sensorada única que reconhece distintos estímulos pró-inflamatórios (Figura 1B). Ativadores desta via são denominados estímulos canônicos. Os inflamatórios servem como sensores para componentes microbianos e estresse tecidual, e montam-se para desencadear uma resposta inflamatória robusta através da ativação das caspases inflamatórias¹⁷. A montagem inflamada inicia a ativação caspase-1 para mediar a maturação e a secreção de seus substratos principais pró-IL-1β e pró-IL-18. Esse processo ocorre através de um mecanismo de duas etapas. Primeiro, um estímulo de priming regula a expressão de certas proteínas inflamadas e pró-IL-1β através da ativação da via NF-κB. Em segundo lugar, um estímulo intracelular (canônico) induz a montagem inflamada e o recrutamento de procaspase-1 ^6,7.

Caspase-4 e caspase-5 são os ortopedes humanos da caspase murina-11¹¹. Eles são ativados de forma inflamada e independente por lipopolysacarídeo intracelular (LPS), uma molécula encontrada na membrana externa das bactérias Gram-negativas^18,19,20, e por heme extracelular, um produto da hemólise de glóbulos vermelhos²¹. Foi proposto que o LPS se liga diretamente ao motivo card dessas proteínas e induz sua oligomerização²⁰. A ativação do caspase-4 ou caspase-5 promove a liberação do IL-1β induzindo uma forma inflamatória de morte celular chamada piroptose através do decote da proteína gasdermin D (GSDMD)^18,19. Além disso, o efflux de íons de potássio resultantes da morte piropopótica mediada por caspase-4 e GSDMD induz a ativação do inflamador NLRP3 e posterior ativação do caspase-1^22,23. Portanto, caspase-4, -5 e -11 são considerados sensores intracelulares para LPS que são capazes de induzir piroptose e ativação caspase-1 em resposta a estímulos específicos^11,24.

Figura 1: Caspases inflamatórias e ensaio de complementação de fluorescência caspase-bimolecular (BiFC). (A) Diagrama mostrando o sistema caspase-BiFC, onde dois prodomínios caspase-1 (C1-pro) ligados a cada fragmento não fluorescente de Vênus (Venus-C ou Venus-N) são recrutados para a plataforma de ativação NLRP3, forçando Vênus a se repatar e fluorescer. Este complexo aparece como uma mancha verde sob o microscópio e serve como uma leitura para a proximidade inflamatória induzida por caspase, que é o primeiro passo na ativação do caspase iniciador. (B) Esquema mostrando a organização do domínio de componentes inflamatórios e caspases inflamatórias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Medir a ativação específica de caspases iniciadores é difícil, e não há muitos métodos disponíveis para fazê-lo por abordagens de imagem. A Complementação da Fluorescência Bimolecular Caspase (BiFC) pode ser usada para visualizar a ativação inflamatória de caspase diretamente em células vivas (Figura 1A)²⁵. Esta técnica foi recentemente adaptada para uso em macrófagos derivados de monócitos humanos (MDM)²¹. Caspase BiFC mede o primeiro passo na ativação inflamatória de caspase, induzida proximidade para facilitar a dimerização. A expressão de plasmídeos que codificam o caspase prodomínio contendo card fundido a fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente amarela fotostável Vênus (Venus-C [VC]) e Venus-N [VN]) são usados. Quando os dois prodomínios caspase são recrutados para sua plataforma de ativação ou sofrem proximidade induzida, as duas metades de Vênus são trazidas de perto e forçadas a se reabastecer e fluoresce (ver Figura 1A,B). Isso fornece uma leitura em tempo real da ativação específica de caspase inflamatória.

O MDM humano expressa abundantemente genes inflamados e receptores de reconhecimento de padrões que identificam sinais de perigo e produtos patógenos. Isso fornece um tipo de célula ideal para o interrogatório de vias inflamatórias caspase. Além disso, podem ser derivados do sangue periférico e até mesmo de amostras de pacientes para avaliar a ativação inflamatória de caspase em um estado específico da doença. Este protocolo descreve como introduzir os repórteres de caspase BiFC no MDM usando nucleofecção, um método de transfecção baseado em eletroporação, como tratar as células para induzir a ativação inflamatória do caspase e como visualizar os complexos ativos de caspase usando abordagens de microscopia. Além disso, essa metodologia pode ser adaptada para determinar a composição molecular desses complexos, localização subcelular, cinética e tamanho dessas estruturas altamente ordenadas 25,26,27.