Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Die Caspasen sind eine Familie von Cystein-Aspartat-Proteasen, die in Initiator-Caspasen und Scharfrichter-Caspases gruppiert werden können. Scharfrichter-Caspasen umfassen Caspase-3, -6 und -7. Sie kommen natürlicherweise in Zellen als Dimere vor und werden von den Initiator-Caspasen gespalten, um Apoptose¹ auszuführen. Initiator-Caspasen umfassen menschliche Caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 und -12. Sie werden als inaktive Zymogene (Pro-Caspasen) gefunden, die durch näherungsinduzierte Dimerisierung aktiviert und durch autoproteolytische Spaltung stabilisiert werden ^2,3. Die entzündlichen Caspasen sind eine Teilmenge der Initiator-Caspasen² und umfassen Caspase-1, -4, -5 und -12 beim Menschen sowie Caspase-1, -11 und -12 bei Maus ^4,5. Sie spielen keine apoptotische Rolle, sondern eine zentrale Rolle bei Entzündungen. Sie vermitteln die proteolytische Verarbeitung und Sekretion von Pro-Interleukin (IL)-1β und Pro-IL-18^6,7, den ersten Zytokinen, die als Reaktion auf^pathogene Eindringlinge ^8,9 freigesetzt werden. Caspase-1 wird bei der Rekrutierung für seine Aktivierungsplattform aktiviert; ein Proteinkomplex mit hohem Molekulargewicht, der als Inflammasom bezeichnet wird (Abbildung 1A)¹⁰. Die Dimerisierung von Caspase-4, -5 und -11 erfolgt unabhängig von diesen Plattformen durch einen nicht-kanonischen Inflammasom-Weg^11,12.

Kanonische Inflammasomen sind zytosolische multimere Proteinkomplexe, die aus einem Inflammasom-Sensorprotein, dem Adapterprotein ASC (Apoptose-assoziiertes Speck-ähnliches Protein, das eine CARD enthält) und dem Effektorprotein Caspase-1¹⁰ bestehen. Die am besten untersuchten kanonischen Inflammasomen sind die NOD-ähnliche Rezeptorfamilie, die eine Pyrindomäne (NLRP), NLRP1 und NLRP3 enthält, die NLR-Familie, die eine CARD (NLRC), NLRC4 enthält, und die fehlenden in Melanom 2 (AIM2). Sie enthalten jeweils eine Pyrindomäne, eine CARD oder beide Domänen. Die CARD-Domäne vermittelt die Interaktion zwischen CARD-haltigen Caspasen und ihren Upstream-Aktivatoren. Daher wird das Gerüstmolekül ASC, das aus einer N-terminalen Pyrindomäne (PYD) und einem C-terminalen CARD-Motiv 13,14 besteht, für die Rekrutierung von Caspase-1 zu den NLRP1 10-^, NLRP3 15- und AIM2 ^{16-Inflammasomen} benötigt.

Jedes Inflammasom ist nach seinem einzigartigen Sensorprotein benannt, das unterschiedliche entzündungsfördernde Reize erkennt (Abbildung 1B). Aktivatoren dieses Pfades werden als kanonische Reize bezeichnet. Inflammasomen dienen als Sensoren für mikrobielle Komponenten und Gewebestress und lösen durch Aktivierung der Entzündungskaspasen eine robuste Entzündungsreaktion aus¹⁷. Die Inflammasom-Assemblierung initiiert die Caspase-1-Aktivierung, um die Reifung und Sekretion ihrer Hauptsubstrate pro-IL-1β und pro-IL-18 zu vermitteln. Dieser Prozess erfolgt über einen zweistufigen Mechanismus. Erstens reguliert ein Priming-Stimulus die Expression bestimmter Inflammasom-Proteine und Pro-IL-1β durch Aktivierung des NF-κB-Signalwegs. Zweitens induziert ein intrazellulärer (kanonischer) Reiz die Inflammasom-Assemblierung und Rekrutierung von Prochasase-1 ^6,7.

Caspase-4 und Caspase-5 sind die menschlichen Orthologe der murinen Caspase-11¹¹. Sie werden inflammasomenunabhängig durch intrazelluläres Lipopolysaccharid (LPS), ein Molekül, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien^18,19,20 vorkommt, und durch extrazelluläres Häm, ein Produkt der Hämolyse roter Blutkörperchen ^21, aktiviert. Es wurde vorgeschlagen, dass LPS direkt an das CARD-Motiv dieser Proteine bindet und ihre Oligomerisierung induziert²⁰. Die Aktivierung von Caspase-4 oder Caspase-5 fördert die IL-1β-Freisetzung, indem sie eine entzündliche Form des Zelltods namens Pyroptose durch Spaltung des porenbildenden Proteins Gasdermin D (GSDMD) ^18,19 induziert^. Darüber hinaus induziert der Ausfluss von Kaliumionen, die aus Caspase-4 und GSDMD-vermitteltem pyroptotischem Tod resultieren, die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und die anschließende Aktivierung von Caspase-1^22,23. Daher gelten Caspase-4, -5 und -11 als intrazelluläre Sensoren für LPS, die in der Lage sind, Pyroptose und Caspase-1-Aktivierung als Reaktion auf spezifische Reize^11,24 zu induzieren.

Abbildung 1: Entzündliche Caspasen und Caspase-bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC) Assay. (A) Diagramm des Caspase-BiFC-Systems, bei dem zwei Caspase-1-Prodomänen (C1-pro), die mit jedem nicht-fluoreszierenden Fragment der Venus (Venus-C oder Venus-N) verbunden sind, für die NLRP3-Aktivierungsplattform rekrutiert werden, wodurch die Venus gezwungen wird, sich zu verformen und zu fluoreszieren. Dieser Komplex erscheint als grüner Fleck unter dem Mikroskop und dient als Auslese für entzündliche Caspase-induzierte Nähe, die der erste Schritt bei der Aktivierung der Initiator-Caspase ist. (B) Schematische Darstellung der Domänenorganisation von Inflammasom-Komponenten und entzündlichen Caspasen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Messung der Aktivierung spezifischer Initiatorkaspasen ist schwierig, und es gibt nicht viele Methoden, um dies durch bildgebende Ansätze zu tun. Die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) von Caspase kann verwendet werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen (Abbildung 1A)²⁵. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) ^angepasst21. Caspase BiFC misst den ersten Schritt in der entzündlichen Caspase-Aktivierung, induzierte Nähe, um die Dimerisierung zu erleichtern. Es wird die Expression von Plasmiden verwendet, die für die CARD-haltige Caspase-Prodomain kodieren, die mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des photostablen gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-C [VC]) und Venus-N [VN] verschmolzen sind. Wenn die beiden Caspase-Prodomänen für ihre Aktivierungsplattform rekrutiert werden oder induzierte Nähe erfahren, werden die beiden Venushälften in die Nähe gebracht und gezwungen, sich umzuformen und zu fluoreszieren (siehe Abbildung 1A,B). Dies bietet eine Echtzeit-Anzeige der spezifischen entzündlichen Caspase-Aktivierung.

Humanes MDM exprimiert reichlich Inflammasom-Gene und Mustererkennungsrezeptoren, die Gefahrensignale und pathogene Produkte identifizieren. Dies bietet einen idealen Zelltyp für die Abfrage von entzündlichen Caspasebahnen. Darüber hinaus können sie aus peripherem Blut und sogar aus Patientenproben gewonnen werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung in einem bestimmten Krankheitszustand zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die BiFC-Caspase-Reporter mit Nukleofektion, einer auf Elektroporation basierenden Transfektionsmethode, in MDM eingeführt werden, wie die Zellen behandelt werden, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und wie die aktiven Caspase-Komplexe mit mikroskopischen Ansätzen sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann diese Methodik angepasst werden, um die molekulare Zusammensetzung dieser Komplexe, die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Größe dieser hochgeordneten Strukturen^{zu bestimmen 25,26,27}.