Этот протокол был разработан для изучения димер-додекамер переход TmPep1050, M42 аминоптидазы, на структурном уровне. Это простой трубопровод, начиная от очистки белка и обработки рентгеновских данных. Кристалллогенез, индексация набора данных и молекулярная замена были подчеркнуты в ходе исследования, tmPep1050H60A H307A вариант.
Аминопептиды M42 образуют функционально активные комплексы из 12 подразделений. Их процесс сборки, как представляется, регулируется их металлических ионных кофакторов запуска димер-додекамер перехода. При связывании металлических ионов в активном месте и интерфейсе взаимодействия происходит несколько структурных модификаций, формирующих димеры для содействия самосожасыву. Для наблюдения за такими изменениями, стабильные олигомеры должны быть изолированы до структурного исследования. Сообщается, что здесь метод, который позволяет очистки стабильных додекамеров и димеров TmPep1050, M42 aminopeptidase T. maritima, и их структура определения рентгеновской кристаллографии. Димеры были подготовлены из додекамеров путем удаления металлических ионов с хелатирующим агентом. Без кофактора додекамеры стали менее стабильными и были полностью разобщены при нагревании. Олигомерные структуры были решены с помощью простого молекулярного подхода к замене. Чтобы проиллюстрировать методологию, представлена структура варианта TmPep1050, полностью нарушенного в металлической ионой привязке, не показывающей дальнейшего разбивки димеров на мономеры.
Олигомеризация является преобладающим процессом, который диктует биологические функции многих белков. В Escherichia coli, подсчитано, что только 35% белков мономерных1. Некоторые белки, называемые морфиинами, могут даже принять несколько олигомерных состояний с субъединицами, имеющих различную структуру в каждом олигомеромсостоянии 2. Переход между их олигомерными состояниями часто является способом регулирования белковой активности, поскольку каждое олигомерное состояние может иметь различную специфическую активность или функцию. Несколько примеров морфиены были хорошо документированы в литературе, в частности, porphobilinogenсинтазы 3, HPr киназы /фосфатазы 4, Лон протеазы5, лактатдегидрогеназы 6, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы7, пируваткиназы 8, цитратсинтазы 9, и рибонуклеаза10. Недавно мы описали M42 aminopeptidase TmPep1050, еще один пример фермента с морфеином, как поведение, чья активность зависит от его олигомерныхсостояний 11. Переход между олигомерными состояниями опосредован его металлическими кофакторами, которые вызывают несколько структурных модификаций подразделений.
Семейство аминопептидазы M42 принадлежит к клану MH12,13, и широко распространено среди бактерий и Archaea14. M42 aminopeptidases являются подлинными динуклеарными ферментами, унижающими пептиды до 35 аминокислотных остатков в длину15. Они принимают своеобразную тетраэдрообразную структуру из 12 подразделений с их активными участками, ориентированными на внутреннюю полость. Такое расположение часто описывается как нано-разобщение деятельности, чтобы избежать неконтролируемого протеолиза. Физиологическая функция M42 aminopeptidases может быть связана с протеасомой, гидролизующих пептидов в результатедеградации белка 16,17. Pyrococcus horikoshii обладает четырьмя аминоптидами M42, каждая из которых представляет различные, новзаимодополняющие особенности 18,19,20,21. Сингулярно, гетерокомплексы из двух различных типов подразделений были описаны в P. horikoshii, предполагая существование пептидасомныхкомплексов 22,23.
Несколько структур M42 aminopeptidases были описаны влитературе 11,16,18,19,20,24,25,26. Подразделение состоит из двух различных областей, каталитический домен и домен димеризации. Каталитический домен принимает общий α/β, сохраненный во всем клане MH, архетипический каталитический домен является аминокислотой Ap1 из Vibrio proteolyticus27. Домен димеризации принимает PD-как раз16 и может иметь, в дополнение к своей роли в олигомеризации, роль в управлении доступом к субстрату и связывания во внутренней полости11. Поскольку основной строительный блок является более тусклым, dodecamer часто описывается как объединение шести димеров, каждый димер, расположенный на каждом краю тетраэдр16. Олигомеризация аминопептидас M42 зависит от наличия его металлических кофакторов. Ионы металла Divalent, часто«n 2» и Co2, каталитически участвуют в пептидной привязке и гидролизе. Они находятся в двух различных связывающих участках, а именно на участках М1 и М2. Два металлических ионов также диск и тонко настроить олигомеризации, как попродемонстрировано для PhTET2, PhTET3, PfTET3, и TmPep105011,24,28,29. Когда металлические кофакторы истощаются, dodecamer разбирает на димеры, как в PhTET2, PhTET3, и TmPep105011,16,28, или даже мономеры, как в PhTET2 и PfTET324,29.
Здесь представлен протокол, используемый для изучения структур олигомеров TmPep1050. Этот протокол представляет собой набор распространенных методов, включая очищение белка, скрининг протеолитической активности, кристаллизацию, рентгеновскую дифракцию и молекулярную замену. Подчеркиваются тонкости, присущие работе с металлоконструкцимами, олигомеризацией белка, кристаллизацией белка и молекулярной заменой. Пример исследования также представлен, чтобы показать, может ли tPep1050 dodecamers еще больше разобщиться на мономеры или нет. Для решения этого вопроса, вариант TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, был изучен, чьи металлические связывающие сайты нарушаются путем мутации Его-60 (M2 сайт) и его-307 (M1 сайт) в Ала остатков. Этот протокол может быть размещен для изучения других M42 aminopeptidases или любые metalloenzymes с морфеином, как поведение.
Описанный в настоящем настоящем протоколе позволяет понять переход TmPep1050 на структурном уровне. Методология была испытана ранее для определения структуры обоих TmPep1050 олигомеров11. Наиболее сложным шагом было найти условия, способствующие разобщению додекамеров в стабиль?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Мартину Руверс за то, что она корректировал этот документ и давал конструктивные комментарии. Доступ к лучей Proxima 2 (SYNChrotron SOLEIL) был в пределах групп распределения блоков 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |