פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.
M42 aminopeptidases יוצרים מתחמים פעילים מבחינה פונקציונלית המורכבים מ-12 יחידות משנה. נראה שתהליך ההרכבה שלהם מוסדר על ידי התורמים היונים המתכתיים שלהם, מה שמפעיל מעבר של דימר-דוקאמר. עם כריכת יון מתכת, מספר שינויים מבניים מתרחשים באתר הפעיל ובממשק האינטראקציה, מעצבים עמעום לקידום ההרכבה העצמית. כדי לצפות בשינויים כאלה, אוליגומרים יציבים חייבים להיות מבודדים לפני מחקר מבני. דווח כאן היא שיטה המאפשרת טיהור של dodecamers יציבים ועמומים של TmPep1050, M42 aminopeptidase של T. maritima, ואת קביעת המבנה שלהם על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. דימרים הוכנו מ-dodecamers על ידי הסרת יונים מתכת עם סוכן chelating. ללא קופקטור שלהם, dodecamers הפך פחות יציב ונתק לחלוטין עם החימום. המבנים האוליגומריים נפתרו על ידי גישת ההחלפה המולקולרית הפשוטה. כדי להמחיש את המתודולוגיה, המבנה של גרסה TmPep1050, פגום לחלוטין בכריכת יון מתכת, מוצג לא מראה פירוט נוסף של dimers מונומרים.
אוליגומרציה היא תהליך דומיננטי המכתיב את הפונקציות הביולוגיות של חלבונים רבים. ב Escherichia קולי, ההערכה היא כי רק 35% של חלבונים הם מונומריים1. חלבונים מסוימים, הנקראים מורפיינים, יכולים אפילו לאמץ מספר מצבים אוליגומריים עם יחידות משנה בעל מבנה נפרד בכל מצב אוליגומרי2. המעבר בין מצבם האוליגומרי הוא לעתים קרובות מתכוון לווסת את פעילות החלבון כמו כל מצב אוליגומרי עשוי להיות פעילות או פונקציה ספציפית שונה. מספר דוגמאות למורפיין תועדו היטב בספרות, במיוחד את סינתאזפורפובילינוגן 3, HPr קינאז/פוספטאז4, פרוטאזלון 5, להקטאט דהידג’נאז6, גליצרלדהיד-3-פוספט דהידג’נאז7, פירווט קינאז8, סינתזיטציטראט 9, וריבנוקלאז A10. לאחרונה, תיארנו M42 aminopeptidase TmPep1050, דוגמה נוספת של אנזים עם התנהגות כמו מורפיין, שפעילותו תלויה במצבים האוליגומרייםשלה 11. המעבר בין המדינות האוליגומריות שלה מתווכת על ידי הגורמים המתכתיים שלה, מה שגורמים למספר שינויים מבניים של יחידות המשנה.
משפחת M42 aminopeptidase שייכת לשבט MH12,13, והיא מחולקת באופן נרחב בקרב חיידקים וארכאה14. M42 aminopeptidases הם אנזימים די-גרעין אמיתיים משפיל פפטידים עד 35 שאריות חומצת אמינובאורך 15. הם מאמצים מבנה מוזר בצורת טטריהדרון עשוי מ-12 יחידות משנה עם האתרים הפעילים שלהם הכיוון לחלל הפנימי. הסדר כזה מתואר לעתים קרובות בשם ננו-מידור של הפעילות כדי למנוע פרוטאוליזה בלתי מבוקרת. הפונקציה הפיזיולוגית של M42 aminopeptidases עשוי להיות קשור פרוטאזום, פפטידים הידרוליזההנובעים מירידהבחלבון 16,17. Pyrococcus horikoshii בעל ארבעה M42 aminopeptidases, כל אחד מציג ייחודי אך משליםפרטים 18,19,20,21. באופן ייחודי, תסביכות הטרוסקסואליות המורכבות משני סוגים שונים של יחידות משנה תוארו בפ. horikoshii, מה שמצביע על קיומם שלמתחמים פפטידים 22,23.
בספרות תוארו מספר מבנים של M42 aminopeptidases11,16,18,19,20,24,25,26. תחום המשנה מורכב משני תחומים נפרדים, קבוצת מחשבים קתטית ותחום דימיטים. התחום הקתליטי מאמץ פיפול α/β משותף שנצמר בכל שבט MH, התחום הקטליטי הארכיטיפי הוא ה-Ap1 של Vibrio proteolyticus27. תחום dimerization מאמצת קיפול PDZ כמו16 ואולי יש, בנוסף לתפקידה oligomerization, תפקיד בשליטה על גישה למצע ואיגוד בחלל הפנימי11. מכיוון שאבן הבניין הבסיסית היא עמומה יותר, מתואר ה-dodecamer לעתים קרובות כשיוך של שישה דימרים, שכל אחד מהם ממוקם בכל קצה של טטרהדרון16. אוליגומרציה של M42 aminopeptidases מסתמך על הזמינות של cofactors מתכת שלה. יונים מתכת Divalent, לעתים קרובות Zn2+ ו Co2+, מעורבים באופן קטליטי בכריכת פפטיד והידרוליזה. הם נמצאים בשני אתרי איגוד נפרדים, כלשהם אתרי M1 ו-M2. שני יונים מתכת גם לנהוג ולכוונן היטב את oligomerization כפי שהוכח עבור PhTET2, PhTET3, PfTET3, ו TmPep105011,24,28,29. כאשר cofactors מתכת מתרוקן, dodecamer מתפרק לתוך dimers, כמו PhTET2, PhTET3, ו TmPep105011,16,28,או אפילו מונומרים, כמו PhTET2 ו PfTET324,29.
מוצג כאן פרוטוקול המשמש לחקר המבנים של TmPep1050 אוליגומרים. פרוטוקול זה הוא קבוצה של שיטות נפוצות כולל טיהור חלבונים, הקרנת פעילות פרוטאוליטית, התגבשות, מפזר רנטגן, והחלפת מולקולרית. הדקויות הטמונות בהתמודדות עם מטאלואנזימים, אוליגומריזציה של חלבונים, התגבשות חלבונים והחלפת מולקולרית מודגשות. מקרה של מחקר מוצג גם כדי להראות אם TmPep1050 dodecamers עשויים עוד יותר לנתק לתוך מונומרים או לא. כדי לטפל בשאלה זו, גרסה TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, נחקרה שאתרי כריכת המתכת שלהם נפגעים על ידי מוטציה שלו-60 (אתר M2) ו His-307 (אתר M1) כדי Ala שאריות. פרוטוקול זה עשוי להיות מתאים ללמוד aminopeptidases M42 אחרים או כל מטאלואנזימים עם התנהגות כמו מורפיין.
הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הבנת המעבר של דמר-dodecamer של TmPep1050 ברמה המבנית. המתודולוגיה מנוסה בעבר לקביעת המבנה של שני TmPep1050 אוליגומרים11. הצעד המאתגר ביותר היה למצוא תנאים המקדמים את הניתקות של dodecamers לעמומים יציבים. תנאים כאלה היו צריכים להיות קלים מספיק כדי לאפשר שיוך מחדש של ד?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למרטין רובר על הגהה של המאמר הזה ועל מתן הערות מועילות. הגישה לקו הקרן של Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) הייתה בתוך קבוצות הקצאת בלוקים 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |