Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.
As aminopeptidases M42 formam complexos funcionalmente ativos feitos de 12 subunidades. Seu processo de montagem parece ser regulado por seus cofatores de íons metálicos desencadeando uma transição dimer-dodecamer. Após a ligação de íon metálico, várias modificações estruturais ocorrem no local ativo e na interface de interação, moldando dimers para promover a auto-montagem. Para observar tais modificações, os oligômeros estáveis devem ser isolados antes do estudo estrutural. Relatado aqui é um método que permite a purificação de dodecamers estáveis e dimers de TmPep1050, um M42 aminopeptidase de T. maritima, e sua determinação estrutural por cristalografia de raios-X. Dimers foram preparados de dodecamers removendo íons metálicos com um agente quelaante. Sem seu cofator, os dodecamers tornaram-se menos estáveis e foram totalmente dissociados após o aquecimento. As estruturas oligomeméricas foram resolvidas pela abordagem de substituição molecular direta. Para ilustrar a metodologia, a estrutura de uma variante TmPep1050, totalmente prejudicada na ligação de íons metálicos, é apresentada sem mais quebra de dimers aos monômeros.
A oligomerização é um processo predominante que dita as funções biológicas de muitas proteínas. Em Escherichia coli,estima-se que apenas 35% das proteínas são monoméricas1. Algumas proteínas, chamadas morfinas, podem até adotar vários estados oligomericos com subunidades com estrutura distinta em cada estado oligomerico2. A transição entre seus estados oligomericos é frequentemente uma média para regular a atividade proteica, pois cada estado oligomerico pode ter uma atividade ou função específica diferente. Vários exemplos de morfinas foram bem documentados na literatura, notavelmente o porfobilinogen synthase3, HPr kinase/fosphatase4, Lon protease5, lactato desidrogenase6, glicealdeído-3-fosfato desidrogenase7, pyruato kinase8, citrato synthase9, e ribonuclease A10. Recentemente, descrevemos o M42 aminopeptidase TmPep1050, outro exemplo de enzima com comportamento semelhante à morfina, cuja atividade depende de seus estados oligoméricos11. A transição entre seus estados oligoméricos é mediada por seus cofatores metálicos que induzem várias modificações estruturais das subunidades.
A família Aminopeptidase M42 pertence ao clã MH12,13, e é amplamente distribuída entre bactérias e Archaea14. As aminopeptidases M42 são enzimas dinucleares genuínas que degradam peptídeos até 35 resíduos de aminoácidos no comprimento15. Eles adotam uma estrutura peculiar em forma de tetraedro feita de 12 subunidades com seus locais ativos orientados para uma cavidade interna. Tal arranjo é frequentemente descrito como uma nano-compartimentação da atividade para evitar a proteólise descontrolada. A função fisiológica das aminopeptidases M42 pode estar associada aos peptídeos protealôs e hidrolise resultantes da degradação proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possui quatro aminopeptidases M42, cada uma apresentando especificidades distintas, mas complementares18,19,20,21. Singularmente, heterocomplexos feitos de dois tipos diferentes de subunidades foram descritos em P. horikoshii, sugerindo a existência de complexos peptidasome22,23.
Várias estruturas de aminopeptidases M42 foram descritas na literatura11,16,18,19,20,24,25,26. A subunidade é composta de dois domínios distintos, um domínio catalítico e um domínio de dimerização. O domínio catalítico adota uma dobra de α/β comum conservada em todo o clã MH, sendo o domínio catalítico arquetípico o Aminopeptidase Ap1 do Vibrio proteolyticus27. O domínio de dimerização adota uma dobra16 semelhante a PDZ e pode ter, além de seu papel na oligomerização, um papel no controle do acesso substrato e vinculação na cavidade interna11. Como o bloco de construção básico é um dimer, o dodecamer é frequentemente descrito como a associação de seis dimers, cada escurecer sendo posicionado em cada borda do tetraedro16. A oligomerização das aminopeptidases M42 depende da disponibilidade de seus cofatores metálicos. Íons metálicos divalentos, muitas vezes Zn2+ e Co2+, estão catalíticos envolvidos na ligação de peptídeos e hidrólise. Eles são encontrados em dois locais de ligação distintos, ou seja, locais M1 e M2. Os dois íons metálicos também dirigem e ajustam finamente a oligomerização como demonstrado para PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando os cofatores metálicos estão esgotados, o dodecamer desmonta em dimers, como em PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28, ou mesmo monômeros, como em PhTET2 e PfTET324,29.
Apresentado aqui é um protocolo utilizado para estudar as estruturas de oligômeros TmPep1050. Este protocolo é um conjunto de métodos comuns, incluindo purificação de proteínas, triagem de atividade proteolítica, cristalização, difração de raios-X e substituição molecular. São enfatizadas sutilezas inerentes ao enfrentamento das metalloenzymias, oligomerização de proteínas, cristalização de proteínas e substituição molecular. Um caso de estudo também é apresentado para mostrar se os dodecamers TmPep1050 podem se dissociar ainda mais em monômeros ou não. Para abordar essa questão, uma variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A,foi estudada cujos locais de ligação metálica são prejudicados pela mutação de Seu-60 (local M2) e Seu-307 (local M1) para resíduos de Ala. Este protocolo pode ser acomodado para estudar outras aminopeptidases M42 ou quaisquer metalloenzymes com comportamento semelhante à morfina.
O protocolo aqui descrito permite compreender a transição dimer-dodecamer de TmPep1050 no nível estrutural. A metodologia foi experimentada anteriormente para determinar a estrutura de ambos os oligômeros TmPep105011. O passo mais desafiador foi encontrar condições que promovessem a dissociação dos dodecamers em escurecimentos estáveis. Tais condições tinham que ser leves o suficiente para permitir a reassociação de dimers em dodecamers quando o cofator de íons metálicos foi adicion…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Martine Roovers por revisar este artigo e fazer comentários construtivos. O acesso à linha de feixe Proxima 2 (síncrotron SOLEIL) estava dentro dos Grupos de Alocação de Blocos 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |