وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة التحول dimer-dodecamer من TmPep1050، M42 aminopeptidase، على المستوى الهيكلي. وهو خط أنابيب مباشر يبدأ من تنقية البروتين إلى معالجة بيانات الأشعة السينية. وقد تم التأكيد على كريستالودينسيس، فهرسة مجموعة البيانات، واستبدال الجزيئية من خلال حالة من الدراسة، TmPep1050H60A H307A البديل.
تشكل M42 aminopeptidases مجمعات نشطة وظيفيًا مصنوعة من 12 وحدة فرعية. ويبدو أن عملية التجميع الخاصة بهم تخضع للتنظيم من قبل العوامل المساعدة في أيونات المعادن مما يؤدي إلى انتقال أكثر ظُنًا. عند ربط أيونات المعادن، تحدث عدة تعديلات هيكلية في الموقع النشط وعلى واجهة التفاعل، وتشكيل الخافتات لتعزيز التجمع الذاتي. ولمراقبة هذه التعديلات، يجب عزل القلة المستقرة قبل إجراء دراسة هيكلية. ذكرت هنا هو الأسلوب الذي يسمح لتنقية dodecamers مستقرة وdamers من TmPep1050, M42 aminopeptidase من T. maritima, وتحديد هيكلها بواسطة التصوير البلوري بالأشعة السينية. تم إعداد الديممرات من dodecamers عن طريق إزالة الأيونات المعدنية مع عامل chelating. دون عاملهم المساعد، أصبحت dodecamers أقل استقرارا وتم فصلها تماما عند التدفئة. تم حل الهياكل القلة من خلال نهج الاستبدال الجزيئي المباشر. لتوضيح المنهجية ، يتم عرض هيكل متغير TmPep1050 ، ضعيف تمامًا في ربط الأيونات المعدنية ، يظهر عدم وجود مزيد من الأعطال من الخافضات إلى مونومرات.
10- التنشئة القلائية هي عملية سائدة تملي الوظائف البيولوجية للعديد من البروتينات. في الإشريكية القولونية، ويقدر أن 35٪ فقط من البروتينات هيأحادية 1. بعض البروتينات، ودعا morpheeins، يمكن أن تعتمد حتى العديد من الدول القلة مع وحدات فرعية وجود بنية متميزة في كل دولة أوليغومريك2. الانتقال بين حالاتهم القلة غالبا ما يعني تنظيم نشاط البروتين حيث أن كل ولاية من الدول القلة قد يكون لها نشاط أو وظيفة مختلفة محددة. وقد تم توثيق العديد من الأمثلة على morpheeins جيدا في الأدب ، لا سيما في الporphobilinogen synthase3, HPr kinase /phosphatase4, لون بروتياز5, لاكتات dehydrogenase6, الجلسرينالدهيدي -3-الفوسفات dehydrogenase7, بيروفات كيناز8, سيترات synthase9, وpponuclease A10. في الآونة الأخيرة، وصفنا M42 aminopeptidase TmPep1050، مثال آخر من الانزيم مع سلوك مثل مورفيين، الذي يعتمد نشاطه على الدول القلةلها 11. ويتوسط الانتقال بين دولها القلة من قبل العوامل المساعدة المعدنية التي تحفز العديد من التعديلات الهيكلية لالوحدات الفرعية.
تنتمي عائلة M42 aminopeptidase إلى عشيرة MH12,13, ويتم توزيعها على نطاق واسع بين البكتيريا والارشمية14. و M42 aminopeptidases هي إنزيمات دينوكليار حقيقية الببتيدات المهينة تصل إلى 35 بقايا الأحماض الأمينية في طول15. أنها تعتمد على هيكل غريب على شكل رباعي الهيدرون مصنوعة من 12 وحدات فرعية مع مواقعهم النشطة الموجهة نحو تجويف داخلي. وكثيرا ما يوصف مثل هذا الترتيب بأنه تقسيم نانو للنشاط لتجنب انحلال البروتيل غير المنضبط. قد تكون مرتبطة الوظيفة الفسيولوجية من أمينوببتيداسيس M42 مع البروتيم، الببتيدات التحلل الناجمة عن تدهور البروتين16،17. Pyrococcus horikoshii تمتلك أربعة M42 أمينوببتيداسيس، كل عرض خصوصيات متميزة ولكن متكاملة18,19,20,21. فريد, وقد وصفت هيتيروكوميكس مصنوعة من نوعين مختلفين من الوحدات الفرعية في p. horikoshii, مما يشير إلى وجود مجمعات ببتيداسوم22,23.
وقد وصفت عدة هياكل من M42 أمينوببتيداسيس في الأدب11،16،18،19،20،24،25،26. وتتألف هذه الunit من مجالين مختلفين، مجال حفاز ومجال اتم. المجال الحفاز يعتمد α المشتركة / β أضعاف محفوظة في عشيرة MH كله، والمجال الحفاز الأركيولوجية يجري أمينوببتيداز Ap1 من فيبريو proteolyticus27. يعتمد المجال الديمّر طية تشبه PDZ16 وقد يكون لها دور في oligomerization ، بالإضافة إلى دورها في التحكم في الوصول الركازة والتجليد في التجويف الداخلي11. كما اللبنة الأساسية هو أكثر خافة، وغالبا ما يوصف dodecamer بأنها رابطة من ستة خافمات، كل خافض يجري وضعها في كل حافة من tetrahedron16. يعتمد احتكار أعضاء M42 aminopeptidases على توافر العوامل المساعدة المعدنية. أيونات المعادن المبرومة، وغالباً ما زن2 + وCo2+، وتشارك بشكل تحفيزي في الربط الببتيد والتحلل المائي. وهي موجودة في موقعين مختلفين للربط، وهما موقعي M1 و M2. أيونات معدنية اثنين أيضا محرك وصقل االتائح كما هو موضح لPhTET2، PhTET3، PfTET3، وTmPep105011،24،28،29. عندما تنضب العوامل المساعدة المعدنية، وdedecamer تفكيك في العتيمات، كما هو الحال في PhTET2، PhTET3، وTmPep105011،16،28، أو حتى مونومرات، كما هو الحال في PhTET2 وPfteT324،29.
هنا هو بروتوكول يستخدم لدراسة هياكل oligomers TmPep1050. هذا البروتوكول هو مجموعة من الطرق الشائعة بما في ذلك تنقية البروتين، وفحص نشاط البروتيوليك، والتبلور، وانعراج الأشعة السينية، والاستبدال الجزيئي. وأكد على الدقة الكامنة في التعامل مع metalloenzymes، oligomerization البروتين، وبلورة البروتين واستبدال الجزيئية. كما يتم عرض حالة من الدراسة لإظهار ما إذا كان dodecamers TmPep1050 قد تتفكك إلى مونومرات أم لا. لمعالجة هذا السؤال، تم دراسة متغير TmPep1050، TmPep1050H60A H307A، مواقع ربط المعادن التي تضعف من قبل تحور له -60 (موقع M2) وه – 307 (موقع M1) إلى بقايا علاء. قد يتم استيعاب هذا البروتوكول لدراسة أخرى M42 أمينوببتيداسيس أو أي metalloenzymes مع سلوك مثل morpheein.
البروتوكول الموصوف هنا يسمح بفهم انتقال dimer-dodecamer من TmPep1050 على المستوى الهيكلي. وقد شهدت منهجية سابقا لتحديد هيكل كل من oligomers TmPep105011. وكانت الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف تعزز تفكك الـddecamers إلى خافضات مستقرة. وكان على هذه الظروف أن تكون خفيفة بما يكفي للسماح بإعادة دمج الخافت?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر مارتين رووفر على تصحيح هذه الورقة وتقديم تعليقات بناءة. كان الوصول إلى خط الشعاع Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) ضمن مجموعات تخصيص الكتلة 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |