Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un’amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all’elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l’indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.
Le amminopeptidasi M42 formano complessi funzionalmente attivi fatti di 12 subunità. Il loro processo di assemblaggio sembra essere regolato dai loro cofattori ionici metallici che innescano una transizione dimero-dodecamero. Al momento del legame ionici metallici, si verificano diverse modifiche strutturali nel sito attivo e nell’interfaccia di interazione, modellando i dimeri per promuovere l’auto-assemblaggio. Per osservare tali modifiche, gli oligomeri stabili devono essere isolati prima dello studio strutturale. Qui riportato è un metodo che consente la purificazione di dodecamer stabili e dimeri di TmPep1050, un amminopeptidasi M42 di T. maritimae la loro determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. I dimeri venivano preparati da dodecamer rimuovendo ioni metallici con un agente chelatante. Senza il loro cofattore, i dodecamer divennero meno stabili e furono completamente dissociati al riscaldamento. Le strutture oligomeriche sono state risolte con il semplice approccio di sostituzione molecolare. Per illustrare la metodologia, viene presentata la struttura di una variante TmPep1050, totalmente compromessa nel legame ionici metallici, che non mostra ulteriori dimeri in monomeri.
L’oligomerizzazione è un processo predominante che detta le funzioni biologiche di molte proteine. In Escherichia coli, si stima che solo il 35% delle proteine siano monomeriche1. Alcune proteine, chiamate morfeeine, possono anche adottare diversi stati oligomerici con subunità aventi una struttura distinta in ogni stato oligomerico2. La transizione tra i loro stati oligomerici è spesso una media per regolare l’attività proteica in quanto ogni stato oligomerico può avere un’attività o una funzione specifica diversa. Diversi esempi di morfeeine sono stati ben documentati in letteratura, in particolare il porfobilinogeno sintasi3, HPr chinasi/fosfatasi4, Lon proteasi5, lattato deidrogenasi6, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi7, piruvato chinasi8, citrato sintasi9e ribonucleasi A10. Recentemente, abbiamo descritto l’amminopeptidasi M42 TmPep1050, un altro esempio di enzima con comportamento simile alla morfeina, la cui attività dipende dai suoi stati oligomerici11. La transizione tra i suoi stati oligomerici è mediata dai suoi cofattori metallici che inducono diverse modifiche strutturali delle subunità.
La famiglia M42 aminopeptidasi appartiene al clan MH12,13,ed è ampiamente distribuita tra Batteri e Archaea14. Le amminopeptidasi M42 sono veri enzimi dinucleari che degradano peptidi fino a 35 residui di amminoacidi inlunghezza 15. Adottano una particolare struttura a forma di tetraedro composta da 12 subunità con i loro siti attivi orientati verso una cavità interna. Tale disposizione è spesso descritta come una nano-compartimentazione dell’attività per evitare la proteolisi incontrollata. La funzione fisiologica delle amminopeptidasi M42 può essere associata al proteasome, peptidi idrolizzando risultanti dalla degradazione proteica16,17. Pyrococcus horikoshii possiede quattro aminopeptidasi M42, ognuna delle quali presenta specifiche distinte ma complementari18,19,20,21. Singolarmente, eterocomplessi fatti di due diversi tipi di subunità sono stati descritti in P. horikoshii, suggerendo l’esistenza di complessi peptidasomei22,23.
Diverse strutture di M42 aminopeptidasi sono state descritte nellaletteratura 11,16,18,19,20,24,25,26. La subunità è composta da due domini distinti, un dominio catalitico e un dominio di dimerizzazione. Il dominio catalitico adotta una comune piega α/β conservata in tutto il clan MH, il dominio catalitico archetipico è l’amminopeptidasi Ap1 di Vibrio proteolyticus27. Il dominio di dimerizzazione adotta una piega16 simile a PDZ e può avere, oltre al suo ruolo nell’oligomerizzazione, un ruolo nel controllo dell’accesso al substrato e del legame nella cavitàinterna 11. Poiché l’elemento costitutivo di base è un dimero, il dodecamero è spesso descritto come l’associazione di sei dimeri, ognuno dei quali è posizionato ad ogni bordo del tetraedro16. L’oligomerizzazione delle aminopeptidasi M42 si basa sulla disponibilità dei suoi cofattori metallici. Gli ioni metallici divalenti, spesso Zn2+ e Co2+,sono cataliticamente coinvolti nel legame peptidico e nell’idrolisi. Si trovano in due siti di binding distinti, vale a dire siti M1 e M2. I due ioni metallici guidano e ottimizzano finemente l’oligomerizzazione come dimostrato per PhTET2, PhTET3, PfTET3 e TmPep105011,24,28,29. Quando i cofattori metallici sono esauriti, il dodecamero si smonta in dimeri, come in PhTET2, PhTET3 e TmPep105011,16,28o anche monomeri, come in PhTET2 e PfTET324,29.
Presentato qui è un protocollo utilizzato per studiare le strutture degli oligomeri TmPep1050. Questo protocollo è un insieme di metodi comuni tra cui la purificazione proteica, lo screening dell’attività proteolitica, la cristallizzazione, la diffrazione dei raggi X e la sostituzione molecolare. Vengono enfatizzate le sottigliezze inerenti alla gestione dei metalloenzimi, all’oligomerizzazione proteica, alla cristallizzazione proteica e alla sostituzione molecolare. Viene inoltre presentato un caso di studio per dimostrare se i dodecamer TmPep1050 possono dissociarsi ulteriormente in monomeri o meno. Per rispondere a questa domanda, è stata studiata una variante TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, i cui siti di legame metallico sono compromessi mutando i residui di His-60 (sito M2) e His-307 (sito M1) ad Ala. Questo protocollo può essere ospitato per studiare altre amminopeptidasi M42 o qualsiasi metalloenzima con comportamento simile alla morfeina.
Il protocollo qui descritto consente di comprendere la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050 a livello strutturale. La metodologia è stata sperimentata in precedenza per determinare la struttura di entrambi gli oligomeri TmPep105011. Il passo più impegnativo è stato quello di trovare le condizioni che promuoveno la dissociazione dei dodecamer in dimeri stabili. Tali condizioni dovevano essere abbastanza miti da consentire la riassociazione dei dimeri in dodecamer al momento dell’aggiunta d…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Martine Roovers per aver corretto questo documento e per aver dato commenti costruttivi. L’accesso alla linea di travi Proxima 2 (sincrotrone SOLEIL) rientrava nei gruppi di allocazione dei blocchi 20151139.
1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
Index | Hampton Research | HR2-144 | |
Litholoops | Molecular Dimensions | ||
L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |