Summary

Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

Published: February 11, 2020
doi:

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.

Abstract

Fetale Alkoholspektrumsstörungen (FASD) beschreiben ein hochvariables Kontinuum von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern, einschließlich Gesichtsdysmorphologien und neurologischen Beeinträchtigungen. Bei einer komplexen Pathologie betrifft FASD etwa 1 von 100 Kindern, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden. Aufgrund der sehr variablen Natur von FASD haben sich Tiermodelle in unserem aktuellen mechanistischen Verständnis von ethanolinduzierten Entwicklungsfehlern als kritisch erwiesen. Immer mehr Laboratorien konzentrieren sich auf die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten, genetisch befruchtbaren, durchscheinenden Embryonen. Dies ermöglicht es Forschern, Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition in mehreren genetischen Kontexten präzise zu steuern und die Auswirkungen der embryonalen Ethanol-Exposition durch Live-Bildgebungstechniken zu quantifizieren. Zusammen mit dem hohen Grad an Erhaltung sowohl der Genetik als auch der Entwicklung beim Menschen hat sich der Zebrafisch als ein starkes Modell erwiesen, um die mechanistische Grundlage der Ethanol-Teratogenität zu untersuchen. Die Ethanolexpositionsschemas unterscheiden sich jedoch zwischen verschiedenen Zebrafischstudien, was die Interpretation von Zebrafischdaten in diesen Studien verwirrt hat. Hier ist ein Protokoll zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.

Introduction

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschreibt eine breite Palette von neurologischen Beeinträchtigungen und craniofacial Dysmorphologien im Zusammenhang mit embryonalen Ethanol-Exposition1. Mehrere Faktoren, einschließlich Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition und genetischen Hintergrund, tragen zur Variation von FASD2,3. Beim Menschen macht die komplexe Beziehung dieser Variablen das Studium und Verständnis der Ätiologie der FASD schwierig. Tiermodelle haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlage der Ethanol-Teratogenität erwiesen. Eine Vielzahl von Tiermodellsystemen wurde verwendet, um mehrere Aspekte der FASD zu untersuchen, und die Ergebnisse stimmten bemerkenswert mit dem überein, was bei der Exposition beim Menschen gefunden wird4. Nagetiermodellsysteme werden verwendet, um viele Aspekte von FASD zu untersuchen, wobei Mäuse die häufigsten5,6,7sind. Der Großteil dieser Arbeit konzentrierte sich auf Entwicklungsdefekte bei früher Ethanol-Exposition8, obwohl sich eine spätere Exposition gegenüber Ethanol als Entwicklungsanomalien sowie9erwiesen hat. Darüber hinaus haben die genetischen Fähigkeiten von Mäusen in unserer Fähigkeit, die genetischen Grundlagen von FASD10,11zu erforschen, stark unterstützt. Diese Studien an Mäusen deuten stark darauf hin, dass es Gen-Ethanol-Wechselwirkungen mit dem Schall-Igel-Signalweg, Retinsäure-Signalisierung, Superoxid-Dismutase, Stickoxid-Synthase I, Aldh2 und Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,20,21. Diese Studien zeigen, dass Tiermodelle entscheidend sind, um unser Verständnis von FASD und seinen zugrunde liegenden Mechanismen zu fördern.

Der Zebrafisch hat sich als ein leistungsfähiges Modellsystem entwickelt, um viele Aspekte der Ethanolteratogenese22,23zu untersuchen. Aufgrund ihrer externen Befruchtung, hohen Fruchtbarkeit, genetischen Traktionsfähigkeit und Live-Bildgebung sind Zebrafische ideal geeignet, um Faktoren wie Timing, Dosierung und Genetik der Ethanol-Teratogenese zu untersuchen. Ethanol kann präzise inszenierten Embryonen verabreicht werden und die Embryonen können dann abgebildet werden, um die direkte Wirkung von Ethanol während der Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Diese Arbeit kann direkt mit dem Menschen in Verbindung gebracht werden, da die genetischen Entwicklungsprogramme zwischen Zebrafischen und Menschen stark konserviert sind und daher helfen können, FASD-Humanstudien zu leiten24. Während Zebrafische verwendet wurden, um Ethanol-Teratogenese zu untersuchen, macht ein Mangel an Konsens bei der Meldung embryonaler Ethanolkonzentrationen den Vergleich mit Menschen schwierig25. In Säugetiersystemen korrelieren Blutalkoholwerte direkt mit dem Ethanolspiegel des Gewebes26. Viele der Zebrafisch-Studien behandeln Embryonen vor der vollständigen Bildung ihres Kreislaufsystems. Da keine mütterliche Probe zu untersuchen ist, ist ein Verfahren zur Bewertung der Ethanolkonzentrationen erforderlich, um den Ethanolgehalt im Embryo zu quantifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in einem sich entwickelnden Zebrafisch-Embryo mittels Kopfraumgaschromatographie.

Protocol

Alle zebrafischen Embryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden nach den etablierten IACUC-Protokollen27aufgezogen und gezüchtet. Diese Protokolle wurden von der University of Texas at Austin und der University of Louisville genehmigt. HINWEIS: Die Zebrafischlinie Tg (fli1:EGFP)y1 wurde in dieser Studie verwendet28. Bei allem Wasser, das in diesem Verfahren verwendet wird, ist steriles Umkehrosmosewasser. Alle …

Representative Results

Der Ethanolgehalt im Blut kann bei frühen embryonalen Zebrafischen nicht bestimmt werden, da es an einem voll ausgebildeten Kreislaufsystem fehlt. Um die Ethanolkonzentration in den Zebrafischembryonen zu bestimmen, werden die Ethanolwerte direkt aus homogenisiertem embryonalem Gewebe gemessen. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig messen zu können, muss das embryonale Volumen berücksichtigt werden. Der Embryo (Dotter befestigt) sitzt in der Chorion (Eierschale) umgeben von extraembryonaler Flüssigkeit (<…

Discussion

Als Entwicklungsmodellsystem sind Zebrafische ideal geeignet, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Entwicklung zu untersuchen. Sie produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, was präzise Timing- und Dosierungsparadigmen in Ethanolstudien ermöglicht. Zusammen mit den Live-Bildgebungsfunktionen und der genetischen und Entwicklungserhaltung mit Menschen machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für teratologische Studien. Described ist ein Protokoll zur Messung embryonaler…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch frühere Stipendien der National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 an J.K.E. unterstützt. und National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wir danken Rueben Gonzales für die Bereitstellung und Unterstützung bei der Analyse von Gaschromatographen. Wir danken Tiahna Ontiveros und Dr. Gina Nobles beim Schreiben.

Materials

Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

Referencias

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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