القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الرأس الفضائية
Summary
يصف هذا العمل بروتوكولًا لقياس مستويات الإيثانول في جنين حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس من طرق التعرض المناسبة لمعالجة الأجنة وتحليل الإيثانول.
Abstract
تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) سلسلة متصلة متغيرة للغاية من عيوب النمو الناجمة عن الإيثانول، بما في ذلك خلل في الشكل وإعاقات عصبية. مع علم الأمراض المعقد ، يؤثر FASD على ما يقرب من 1 من كل 100 طفل يولدون في الولايات المتحدة كل عام. نظرًا للطبيعة المتغيرة للغاية لـ FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها الحاسمة في فهمنا الآلي الحالي لعيوب التنمية الناجمة عن الإيثانول. وقد ركز عدد متزايد من المختبرات على استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. تنتج سمكة الحمار الوحشي أعدادًا كبيرة من الأجنة الملقحة خارجيًا والقابلة للنقل وراثيًا والشفافة. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم الدقيق في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات وراثية متعددة وتحديد تأثير التعرض للإيثانول الجنيني من خلال تقنيات التصوير الحي. وقد ثبت أن هذا ، إلى جانب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من علم الوراثة والتنمية مع البشر ، هو نموذج قوي لدراسة الأساس الآلي لمسخالإيثانول. ومع ذلك، فقد تنوعت نظم التعرض للإيثانول بين دراسات مختلفة لسمك الحمار الوحشي، مما أربك تفسير بيانات سمك الحمار الوحشي عبر هذه الدراسات. هنا هو بروتوكول لتحديد تركيزات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.
Introduction
تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) مجموعة واسعة من العاهات العصبية وخلل الشكل القحفي المرتبط بالتعرض للإيثانول الجنيني1. عوامل متعددة، بما في ذلك توقيت وجرعة التعرض للإيثانول والخلفية الوراثية، تسهم في الاختلاف من FASD2،3. في البشر ، والعلاقة المعقدة من هذه المتغيرات يجعل دراسة وفهم مسببات FASD تحديا. وقد أثبتت النماذج الحيوانية حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الآلي لمسخة الإيثانول. وقد استخدمت مجموعة واسعة من أنظمة النماذج الحيوانية لدراسة جوانب متعددة من FASD وكانت النتائج متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في التعرض في البشر4. وتستخدم أنظمة نموذج القوارض لدراسة العديد من جوانب FASD، مع الفئران كونها الأكثر شيوعا5،6،7. وقد ركزت غالبية هذا العمل على عيوب النمو إلى التعرض المبكر للإيثانول8، على الرغم من التعرض في وقت لاحق للإيثانول وقد ثبت أن يسبب الشذوذ التنموي ة وكذلك9. وعلاوة على ذلك، ساعدت القدرات الوراثية للفئران إلى حد كبير في قدرتنا على التحقيق في الأسس الوراثية لFASD10،11. هذه الدراسات في الفئران تشير بقوة إلى أن هناك تفاعلات الجينية الإيثانول مع مسار القنفذ الصوتية، إشارات حمض الريتينويك، ديسموتاز Superoxide، أكسيد النيتريك synthase الأول، Aldh2 وFancd28،10،11،12،13،14،15،16،18،18، 19،20،21. وتبين هذه الدراسات أن النماذج الحيوانية حاسمة لتعزيز فهمنا لFASD وآلياتها الأساسية.
وقد برز حمار وحشي كنظام نموذج قوي لدراسة العديد من جوانب الايثانول teratogenesis22،23. بسبب الإخصاب الخارجي ، والبراز العالي ، والقدرة الوراثية ، وقدرات التصوير الحي ، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة عوامل مثل التوقيت والجرعة وعلم الوراثة لتولد الإيثانول. يمكن إعطاء الإيثانول للأجنة المحددة بدقة ويمكن بعد ذلك صورة الأجنة لفحص التأثير المباشر للإيثانول أثناء عمليات النمو. هذا العمل يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى البشر، وذلك لأن البرامج الوراثية للتنمية يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين حمار وحشي والبشر، وبالتالي يمكن أن تساعد في توجيه الدراسات الإنسانية FASD24. في حين تم استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص تولد الإيثانول ، فإن عدم وجود توافق في الآراء في الإبلاغ عن تركيزات الإيثانول الجنينية يجعل المقارنة مع البشر صعبة25. في أنظمة الثدييات ، ترتبط مستويات الكحول في الدم مباشرة بمستويات الإيثانول الأنسجة26. العديد من دراسات حمار وحشي علاج الأجنة قبل تشكيل كامل من نظام الدورة الدموية. ومع عدم وجود عينة أمومية لفحصها، يلزم إجراء عملية لتقييم تركيزات الإيثانول لتحديد مستويات الإيثانول داخل الجنين. هنا نصف عملية لقياس تركيزات الإيثانول في جنين حمار وحشي النامية باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكنظام نموذجي تنموي، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة تأثير العوامل البيئية على التنمية. وهي تنتج أعدادا كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا، مما يسمح بمواعيد دقيقة وجرعات نموذجية في دراسات الإيثانول. هذا، جنبا إلى جنب مع قدرات التصوير الحي والحفاظ على الوراثية والتنموية مع البش…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة من خلال المنح السابقة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه القحفي (NIH / NIDCR) R01DE020884 إلى J.K.E. والمعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIH / NIAAA) F32AA021320 إلى C.B.L. وعن طريق المنحة الحالية من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L. نشكر روبن غونزاليس على تقديم ومساعدة في تحليل الكروماتوجراف الغاز. نشكر تياهنا أونتيفيروس والدكتورة جينا نوبلز على المساعدة في الكتابة.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
Referencias
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Biología del desarrollo. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
