Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie
Summary
Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.
Abstract
Foetale Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschrijven een zeer variabel continuüm van ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsstoornissen, met inbegrip van gezichtsdysmorfologieën en neurologische stoornissen. Met een complexe pathologie treft FASD jaarlijks ongeveer 1 op de 100 kinderen die in de Verenigde Staten worden geboren. Door het zeer variabele karakter van FASD zijn diermodellen kritisch gebleken in ons huidige mechanistische begrip van door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten. Steeds meer laboratoria richten zich op het gebruik van zebravissen om door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten te onderzoeken. Zebravissen produceren grote aantallen extern bevruchte, genetisch hardnekkige, doorschijnende embryo’s. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te controleren en de impact van blootstelling aan embryonale ethanol te kwantificeren door middel van live imaging technieken. Dit, gecombineerd met de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling met de mens, heeft bewezen dat zebravis een krachtig model is om de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit te bestuderen. Echter, ethanol blootstelling regimes hebben gevarieerd tussen verschillende zebravissen studies, die de interpretatie van zebravissen gegevens over deze studies heeft verward. Hier is een protocol om ethanolconcentraties in zebravissenembryo’s te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.
Introduction
Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) beschrijven een breed scala aan neurologische stoornissen en craniofaciale dysmorfologieën geassocieerd met blootstelling aan embryonale ethanol1. Meerdere factoren, waaronder timing en dosering van blootstelling aan ethanol en genetische achtergrond, dragen bij aan de variatie van FASD2,3. Bij mensen maakt de complexe relatie van deze variabelen het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD uitdagend. Diermodellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit. Een breed scala van dier model systemen is gebruikt om meerdere aspecten van FASD studie en de resultaten zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in de blootstelling bij de mens4. Knaagdiermodelsystemen worden gebruikt om vele aspecten van de FASD te onderzoeken, waarbij muizen de meest voorkomende5,6,7zijn. Het merendeel van dit werk is gericht op ontwikkelingsfouten aan vroege blootstelling aan ethanol8, hoewel later blootstelling aan ethanol is aangetoond dat ontwikkelingsafwijkingen veroorzaken en9. Bovendien hebben de genetische vermogens van muizen sterk geholpen in ons vermogen om de genetische onderbouwing van FASD10,11te onderzoeken. Deze studies bij muizen suggereren sterk dat er gen-ethanol interacties met de sonische egel route, retinoïne zuur signalering, Superoxide dismutase, stikstofmonoxide synthase I, Aldh2 es Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Deze studies tonen aan dat diermodellen van cruciaal belang zijn voor het bevorderen van ons begrip van De FASD en de onderliggende mechanismen ervan.
De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem om vele aspecten van ethanol teratogenese te onderzoeken22,23. Vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische traktaaten en levende beeldvormingsmogelijkheden, zijn zebravis bij uitstek geschikt om factoren zoals timing, dosering en genetica van ethanolteratogenese te bestuderen. Ethanol kan worden toegediend aan precies geënsceneerde embryo’s en de embryo’s kunnen vervolgens worden afgebeeld om de directe impact van ethanol tijdens ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Dit werk kan rechtstreeks aan mensen worden verwant, omdat de genetische programma’s van ontwikkeling hoogst behouden tussen zebravissen en mensen zijn en daarom kunnen helpen fasd menselijke studies24begeleiden. Terwijl zebravis zijn gebruikt om ethanol te onderzoeken, een gebrek aan consensus in de rapportage van embryonale ethanol concentraties maakt vergelijking met de mens moeilijk25. In zoogdiersystemen correleren de bloedalcoholniveaus rechtstreeks met weefselethanolniveaus26. Veel van de zebravisstudies behandelen embryo’s vóór volledige vorming van hun bloedsomloop. Zonder moedermonster om te onderzoeken, is een proces om ethanolconcentraties te beoordelen nodig om ethanolniveaus in het embryo te kwantificeren. Hier beschrijven we een proces om ethanolconcentraties te kwantificeren in een zich ontwikkelend zebravisembryo met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als ontwikkelingsmodelsysteem zijn zebravissen bij uitstek geschikt om de impact van omgevingsfactoren op de ontwikkeling te bestuderen. Ze produceren grote aantallen extern bevruchte embryo’s, die het mogelijk maakt voor nauwkeurige timing en dosering paradigma’s in ethanol studies. Dit, gecombineerd met de live imaging mogelijkheden en de genetische en ontwikkelingsbescherming met de mens, maken zebravissen een krachtig modelsysteem voor teratologie studies. Beschreven is een protocol voor het meten van embryonale etha…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek gepresenteerd in dit artikel werd ondersteund door eerdere subsidies van national institutes of health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH / NIDCR) R01DE020884 aan J.K.E. en National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wij danken Rueben Gonzales voor het verstrekken en assisteren met gaschromatograaf analyse. Wij danken Tiahna Ontiveros en Dr Gina Nobles schriftelijke hulp.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
Referencias
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Biología del desarrollo. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
