Summary

Оценка острого исцеления ран с использованием dorsal подкожный поливинил алкоголь Губка Имплантация и иссционные хвост овешки раны модели.

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

Здесь описаны две модели заживления ран, одна из которой предназначена для оценки клеточных и цитокинов реакций заживления ран, а другая – для количественной оценки скорости замыкания ран. Эти методы могут быть использованы со сложными моделями заболеваний, таких как диабет для определения механизмов различных аспектов плохого заживления ран.

Abstract

Заживление ран является сложным процессом, который требует упорядоченного прогрессирования воспаления, формирования гранулированной ткани, фиброза и разрешения. Модели Murine обеспечивают ценное механистическое понимание этих процессов; однако, ни одна модель полностью не рассматривает все аспекты реакции заживления ран. Вместо этого, идеально использовать несколько моделей для решения различных аспектов заживления ран. Здесь описаны два различных метода, которые затрагивают различные аспекты реакции заживления ран. В первой модели поливиниловые спиртовые губки подкожно имплантируются вдоль мышечной сум. После поиска губки, клетки могут быть изолированы механические нарушения, и жидкости могут быть извлечены путем центрифугации, что позволяет подробную характеристику клеточных и цитокинов реакции в острой среде раны. Ограничением этой модели является неспособность оценить скорость закрытия ран. Для этого используется модель иссечения хвостовой кожи. В этой модели, 10 мм х 3 мм прямоугольный кусок хвостовой кожи иссесывается вдоль поверхности доза, вблизи основания хвоста. Эту модель можно легко сфотографировать для планиметрического анализа для определения показателей заживления и можно усвоить для гистологического анализа. Оба описанных метода могут быть использованы в генетически измененных штаммов мыши, или в сочетании с моделями сопутствующих заболеваний, таких как диабет, старение или вторичная инфекция, для того, чтобы выяснить механизмы заживления ран.

Introduction

Есть много систем модели мурин доступны для изучения процессов заживления ран, каждый из которых обладает конкретными преимуществами и ограничениями1,2. Следующие методы представляют две модели мурин раны, каждая из которых рассматривает конкретный аспект реакции заживления ран, и которые могут быть использованы для определения причины и следствия возмущений в ответ на травму. Процесс заживления ран происходит в различных фазах. Первая фаза является воспалительной, характеризующейся быстрым притоком тромбоцитов, нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, а также производством провоспалительных цитокинов и хемокин. После разрешения воспаления, окружающая среда переходит в более репаративное состояние с индукцией профибротических и проангиогенных цитокинов и факторов роста. Гранулированная ткань откладывается и неососы образуются с миграцией миофибробластов, фибробластов, эпителиальных клеток и эндотелиальных клеток. На заключительных стадиях перестраивается предварительная внеклеточная матрица, а образование рубцов и замыкание раны происходит2,,33,44,5,66,7,,8.

Ни одна модель мурина не обеспечивает систему для изучения всех стадий заживления ран2. Здесь описаны две хирургические модели ран: одна проясняет острые клеточные и цитокины заживление ран, а другая позволяет оценить закрытие раны, а также гистологические анализы. Эти два метода могут быть использованы в дополнительной форме для оценки последствий возмущения или сопутствующих мер на различные аспекты реакции заживления ран. В розницу подкожной имплантации поливинилового спирта (PVA) губки представляет собой систему, которая была использована в моделях грызунов на протяжении десятилетий, чтобы прояснить многочисленные аспекты клеточной и гранулирующей ткани ответы9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Такой подход позволяет извлекать богатые цитокиновыми раневыми жидкостями и клеточные инфильтраты. В этой модели, 1 см х 1 см х 0,5 см куски pVA губки помещаются в подкожные карманы через 2 см разрез, сделанный на задней дорсальной средней линии. Разрез закрывается хирургическими зажимами, и губки могут быть извлечены в более поздние временные точки для изоляции клеток и жидкости. Клеточная и цитокинская среда изолированных губок отражает нормальные стадии заживления острых ран до 14 дней послеимплантации. В более поздние моменты указывает модель является более выгодным для изучения формирования гранулирования ткани и инородного тела ответ1. С помощью этой системы, можно изолировать йgt;106 клеток, который предлагает явное преимущество для фенотипических и функциональных анализов и ИЗОЛЯЦИи РНК, более изоляции клеток из других методов на основе биопсии1,22,23,25,26.

Скорость замыкания раны определяется с помощью модели иссечения хвостовой кожи. В этой модели, как первоначально описано Falanga et al. и сообщили другие27,28,29,30, 1 см х 0,3 см полная толщина секции хвостовой кожи удаляется вблизи основания хвоста. Область раны легко визуализирована и может быть измерена с течением времени. Кроме того, хвостовая ткань может быть выделена для гистологического анализа. Этот подход может быть использован в качестве альтернативы или в сочетании с устоявшимся методом биопсии пневматического пунша. Основными различиями между этими двумя моделями являются скорость закрытия ран, наличие или отсутствие меха, и структура кожи2,,31,32. Хвост овешки раны предлагают более длительные сроки, в которых для оценки закрытия раны, как это занимает около 21 дней для полного закрытия произойти. Это противопоставляется непорочным кисло-пунш биопсии, которые заживают гораздо быстрее (7-10 дней), в первую очередь за счет сокращения из-за действия panniculus карнос. Splinted dorsal пунша биопсии исцелить медленнее и уменьшить последствия сократительного исцеления, но полагаться на наличие инородного тела, чтобы ограничить сократительных механизмов1,2,27,30,31,33.

Описанные модели ран информативны для понимания нормальных процессов заживления ран при отсутствии возмущения. В то время как заживление кожи грызунов отличается очень значительными способами от кожи человека, включая рыхлую структуру, зависимость от сократительного заживления и другие анатомические различия, муринсистема предлагает определенные преимущества для механистических и скрининговых исследований. На первом месте среди них является наличие инбредных штаммов и генетических мутантов, генетическая усваиваемость и более низкая стоимость. Механистические понимание, полученное из мурин исследований могут быть переведены на сложные модели животных, которые более тесно имитировать заживление кожи человека, таких как свиная система2,31.

В дополнение к изучению реакции заживления ран в устойчивом состоянии, эти модели могут быть объединены с сопутствующими условиями, чтобы понять основу дефектов заживления ран на клеточной, цитокинов, и валового уровня ткани. Именно в этой конкретной обстановке, что две модели могут быть использованы в согласии для оценки последствий конкретного сопутствующих состояний, таких как послеоперационная пневмония, как на острой клеточной реакции заживления рании и скорость закрытияраны 30.

Protocol

Все исследования на животных, описанные здесь, были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Брауна и проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию животных Национальных институтов здравоохранения.  ПРИМЕЧАНИЕ: в видео,…

Representative Results

Системная воспалительная реакция после имплантации губки ПВАОперация по имплантации губки ПВА вызвала системную воспалительную реакцию, о чем свидетельствует индукция ИЛ-6 в плазме через 1 день после ранения(рисунок 2A). Другие провоспалительные цитокины, вк…

Discussion

Эта статья описывает две уступчивые модели раны мурин, которые позволяют оценить острой реакции заживления ран. Первый метод включает в себя хирургическую имплантацию губок ПВА в подкожном пространстве. Этот подход предлагает явное преимущество по сравнению с биопсией на основе раны …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Кевина Карлсона из Брауновского университета потока цитометрии и сортировки фонда для консультаций и помощи с потоком цитометрии экспериментов. Изображения на рисунке 1B и C были созданы с помощью BioRender. Кайла Ли и Грегори Серпа поблагодарили за их фотографической помощи. Эта работа была поддержана гранты от следующих: Оборона Расширенные исследовательские проекты агентства (DARPA) YFAA15 D15AP00100, декан области новых новых наук премии (Браун университета), Национальный институт сердца легких и крови (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Национальный институт экологических наук (NIES) T32-ES7272 (обучение в области экологической патологии), и Браун университета научно-исследовательских семян премии.

Materials

10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum – Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

Referencias

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

View Video