Summary

הערכה של ריפוי בפצע חריפה באמצעות השרכה העור מפוליויניל כוהל של הרקמה העורית והזנב Excisional הפצע מודלים.

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

כאן, שני מודלים מורתיים ריפוי הפצע מתוארים, אחד שנועד להעריך את התגובה התאית הפצע ריפוי והשני כדי לכמת את שיעור סגירת הפצע. שיטות אלה ניתן להשתמש עם דגמי מחלות מורכבות כגון סוכרת כדי לקבוע מנגנונים של היבטים שונים של ריפוי הפצע המסכן.

Abstract

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב הדורש התקדמות מסודרת של דלקת, רקמת היווצרות הגרטולציות, פיברוזיס, ורזולוציה. דגמי מורנה מספקים תובנה מכניסטית רבת ערך בתהליכים אלה; עם זאת, אף דגם יחיד לא מטפל באופן מלא בכל ההיבטים של התגובה ריפוי הפצע. במקום זאת, הוא אידיאלי להשתמש בדגמים מרובים כדי לטפל בהיבטים שונים של ריפוי הפצע. כאן, שתי שיטות שונות הכתובות היבטים מגוונים של תגובת ריפוי הפצע מתוארים. במודל הראשון, ספוגים לאלכוהול פוליוויניל מתת-עורי מושתלים לאורך העכבר dorsum. בעקבות איחזור ספוג, תאים יכולים להיות מבודדים על ידי שיבוש מכני, ונוזלים ניתן לחלץ על ידי צנטריפוגה, ובכך לאפשר אפיון מפורט של תגובות הסלולר וציטוקין בסביבה פצע אקוטי. הגבלה של מודל זה היא חוסר יכולת להעריך את קצב סגירת הפצע. לשם כך, נעשה שימוש במודל כריתה של עור הזנב. בדגם זה, 10 מ”מ x 3 מ”מ פיסת מלבנית של עור זנב הוא מגורש לאורך המשטח האחורי, ליד הבסיס של הזנב. מודל זה ניתן לצלם בקלות עבור ניתוח planimetric כדי לקבוע שיעורי הריפוי ניתן לקבל עבור ניתוח היסטולוגית. שתי השיטות המתוארות יכולות להיות מנוצל בזנים של עכברים ששונו גנטית, או בשילוב עם מודלים של תנאי תחלואה, כגון סוכרת, הזדקנות, או זיהום משני, על מנת להבהיר מנגנוני ריפוי הפצע.

Introduction

יש הרבה מערכות מודל murine זמין כדי לבחון את תהליכי ריפוי הפצע, כל אחד מהם בעל יתרונות ספציפיים ומגבלות1,2. השיטות הבאות מציגות שני דגמים של פציעות מורתיים, שכל אחד מהם מטפל בהיבט מסוים של תגובת הפצע, וניתן להשתמש בו כדי לזהות את הסיבה והתוצאה של רטבאליות בתגובה לפציעה. תהליך ריפוי הפצעים מתרחש בשלבים נפרדים. השלב הראשון הוא דלקתי, מאופיין הזרימה המהירה של טסיות, נויטרופילים, מונוציטים/מקרופאגים, כמו גם הייצור של ציטוקינים proinflammatory ו נוגדנים. בעקבות הרזולוציה של דלקת, הסביבה מעברים למצב משתנה יותר עם אינדוקציה של ציטוקינים profibrotic וגורמי צמיחה. רקמות גרטולציות מופטות ויוצרות צורה עם הגירה של מיופיברופיצוצים, פיברותקיעות, תאי אפיתל ותאי אנדותל. בשלבים הסופיים, מטריקס החילוץ הזמני הוא שופצה, והיווצרות צלקת הסגר הפצע ההכנסות2,3,4,5,6,7,8.

לא מודל murine אחד מספק מערכת ללמוד את כל השלבים של ריפוי הפצע2. כאן, שני מודלים הפצע כירורגי מתוארים: אחד מובהר התאים הסלולר אקוטי הפצע ריפוי, והשני מאפשר הערכה של סגירת הפצע, כמו גם ניתוח היסטולוגית. שתי השיטות הללו עשויות להיות מועסקים בצורה משלימה כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול בהפרעות והתחלואה בהיבטים שונים של תגובת הפצע. השרטת תת עורית של פוליוויניל אלכוהול (pva) ספוגים היא מערכת אשר נעשה שימוש במודלים מכרסמים במשך עשורים כדי להבהיר היבטים רבים של התגובות רקמות תאית וגרטולציות9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24 גישה זו מאפשרת לשליפה של נוזלי הפצע העשיר cytokine ומחלחל הסלולר. במודל זה, 1 ס מ x 1 ס מ x 0.5 ס מ חתיכות של ספוג PVA ממוקמים לתוך כיסים תת עורית דרך חתך 2 ס מ שנעשו על קו האמצע האחורי. החתך סגור עם כירורגי קליפים, ואת הספוגים ניתן לאחזר בזמן מאוחר יותר נקודות בידוד תאים ונוזלים. התקשורת התאית והציטוקין של ספוגים מבודדים משקפת את השלבים הנורמליים של ריפוי הפצע החריף עד 14 ימים פוסטיר. במועד מאוחר יותר המודל הוא יתרון יותר עבור לימוד היווצרות רקמת הגרטולזה ואת תגובת גוף זר1. עם מערכת זו, ניתן לבודד את > 106 תאים, אשר מציעה יתרון ברור עבור הספק פנוטיic ופונקציונלי ובידוד RNA, על בידוד תאים משיטות אחרות המבוססות על ביופסיה1,22,23,25,26.

שיעור סגירת הפצע נקבע באמצעות מודל כריתה של עור הזנב. במודל זה, כפי שמתואר בתחילה על ידי falanga ואח ‘ ודיווחו על ידי אחרים27,28,29,30, 1 ס”מ x 0.3 ס”מ בעובי מקטע של עור זנב מוסר ליד בסיס הזנב. אזור הפציעה הוא מדמיין בקלות, ניתן למדוד לאורך זמן. לחילופין, ניתן לבודד את רקמת הזנב לניתוח היסטולוגית. גישה זו יכולה לשמש כחלופה או בשילוב עם שיטת ביופסיה מבוססת על המכה היטב. ההבדלים העיקריים בין שני מודלים אלה הם שיעור סגירת הפצע, נוכחות או העדר פרווה, ומבנה העור2,31,32. פצעי העור של הזנב מציעים פרק זמן ארוך יותר בו יש להעריך את סגירת הפצע, כפי שנדרש כ -21 יום לסיום מלא. זה מנוגד לunsplinted ביופסיות אגרוף, אשר לרפא מהר הרבה יותר (~ 7-10 ימים), בעיקר על ידי התכווצות בשל הפעולה של הפניקולוס carnosus. Splinted ביופסיות אגרוף לרפא לאט יותר ולצמצם את ההשפעות של ריפוי הקונקטילה, אבל להסתמך על נוכחות של גוף זר כדי להגביל את המנגנון המבוסס על מנגנונים1,2,27,30,31,33.

מודלים הפצע המתואר הם אינפורמטיבי להבנת תהליכי ריפוי נורמליים הפצע בהיעדר הפרטורציה. בעוד הריפוי של העור מכרסם שונה בדרכים משמעותיות מאוד מן העור האנושי, כולל מבנה רופף, הסתמכות על ריפוי הקונקטילה, והבדלים אנטומיים אחרים, מערכת murine מציע יתרונות מסוימים למחקרים מכניסטיים והקרנה. בראש ובראשונה מדובר בזמינות של זנים מוטקיים ומוטציות גנטיות, מסאחיזה גנטית ועלות נמוכה יותר. תובנות מכניסטיות שנרכשו ממחקרים מורתיים ניתן לתרגם למודלים בעלי חיים מורכבים המחקים יותר את ריפוי העור האנושי, כגון מערכת חזירי2,31.

בנוסף לבדיקה של תגובות ריפוי פצעים במצב יציב, מודלים אלה יכולים להיות משולבים עם תנאי טיפול מקבל כדי להבין את הבסיס של מומים ריפוי הפצע בסלולר, cy, ורמת רקמה גסה. זה בהגדרה זו מסוים כי שני הדגמים ניתן להשתמש בקונצרט כדי להעריך את ההשפעות של מצב מסוים בשיעור תחלואה, כגון דלקת ריאות לאחר הניתוח, הן התגובה התאית חריפה הפצע ואת שיעור סגירת הפצע30.

Protocol

כל מחקרים בעלי חיים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת בראון והשתמש וביצע בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות.  הערה: בסרטון הווידאו, המסך הכירורגי הושמט למטרות הדגמה. 1. השתלת תת-עורית של ספוגים PVA השימוש במ…

Representative Results

תגובה דלקתית מערכתית לאחר השתלת ספוג PVAניתוח השתלת ספוג PVA שנוצר תגובה דלקתית מערכתית, כפי שמתואר על ידי אינדוקציה של IL-6 פלזמה 1 יום לאחר פצעו (איור 2A). ציטוקינים אחרים proinflammatory כולל tnf-α ו-IL-1β, כמו גם מערך של נוגדנים כולל CCL2 ו CXCL1 המושרה באופן מערכתית ב -7 ימים הראשונ?…

Discussion

מאמר זה מתאר שני מודלים הפצע murine מורי המאפשרים הערכה של תגובת הפצע לריפוי חריפה. השיטה הראשונה כרוכה ההשתלה כירורגית של ספוגים PVA בחלל תת עורית. גישה זו מציעה יתרון ברור על פני מודלים ביופסיה מבוססי הפצע ללמוד את התגובה התאית הריפוי הפצע בשל מספר גדול של תאים וכמות של נוזלי הפצע שהתקבלו מתו…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות קווין קרלסון של מתקן האוניברסיטה בראון Cy, מיון המרכז לייעוץ וסיוע עם הזרימה cy, try ניסויים. תמונות באיור 1B ו-C נוצרו עם ביוריאנדר. מודה לקיילה לי ולגרגורי סראפה על הסיוע הצילומי שלהם. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן הבאים: הגנה מתקדמים פרויקטים מחקר הסוכנות (DARPA) YFAA15 D15AP00100, התחומים של דיקן פרס המדע החדש המתעוררים (אוניברסיטת בראון), ריאות הלב הלאומי ומכון הדם (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, המכון הלאומי למדעי הסביבה (החקות) T32-ES7272 (אימון בפתולוגיה סביבתית), ופרס הגרעין האוניברסיטאי למחקר באוניברסיטת בראון.

Materials

10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum – Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

Referencias

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

View Video