Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Grande multisubunit proteína complejos fotosistema PSI y PSII, Cyt b₆f y ATPasa coordinan la producción de NADPH y de ATP en las reacciones de luz fotosintéticas. En cloroplastos de plantas superiores, los complejos se encuentran en la membrana del thylakoid, que es una estructura de membrana estructuralmente heterogéneo, compuesto por Appresso grana y tilacoides de estroma no appressed. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método ampliamente utilizado en el análisis de complejos de grande multisubunit proteína en su forma natural y biológicamente activo. El método se estableció para la disección de la membrana mitocondrial proteínas complejos¹, pero más tarde se ha personalizado para la separación de complejos de la proteína de la membrana de tilacoides red³. El método es adecuado (i) para la purificación de complejos proteicos de tilacoides individuales para análisis estructural, (ii) para determinar las interacciones nativas entre complejos de la proteína y (iii) para el análisis de la organización general de los complejos de la proteína a cambio de señales ambientales.

Antes de la separación, complejos de la proteína están aislados de la membrana con cuidada detergentes no iónicos, que son generalmente leves y preservar la estructura de los complejos de la proteína nativa. Los detergentes contienen hidrófobos y sitios hidrofílicos y micelas estable forma por encima de cierta concentración, llamada concentración micelar crítica (CMC). Aumento de la concentración de detergente sobre los resultados de la CMC en la interrupción de las interacciones lípido lípido y en la solubilización de complejos de la proteína. La elección del detergente depende la estabilidad de la proteína de interés y de la capacidad de solubilización del detergente. Detergentes usados habitualmente son α/β-dodecil-maltoside y digitonin. Después de la solubilización de complejos de proteína en su estado nativo, material insoluble se elimina por centrifugación. En las plantas superiores, la membrana del thylakoid es altamente heterogénea en la estructura y algunos detergentes (por ejemplo, digitonin) solubilizan selectivamente sólo una fracción específica de la membrana³. Por lo tanto, para caracterizar la organización compleja de la proteína o las interacciones entre los complejos de proteínas, es crucial determinar siempre la capacidad de solubilización del detergente solicitada por determinar el contenido de clorofila y la clorofila a/b proporción de sobrenadante para evaluar el rendimiento y el dominio mentionada tilacoides (sub), respectivamente, de la fracción solubles. La relación clorofila a/b en tilacoides intacto de luz de crecimiento plantas aclimatadas es típicamente alrededor de 3, mientras que la chl un / b el valor de fracciones de tilacoides en grana enriquecido o tilacoides de estroma inferior (~ 2,5) o superior (~ 4.5) el valor del total tilacoides, respectivamente.

Para proporcionar carga negativa a los complejos de proteínas, colorante de (CBB) de azul brillante de Coomassie se agrega a la muestra solubilizada. Debido al cambio de carga, complejos de proteínas migran hacia el ánodo y se separan en un gradiente de acrilamida (AA) según su masa molecular y la forma. Eficaz y de alta resolución de la separación se logra utilizando un gradiente de concentración de acrilamida lineal. Durante la electroforesis, los complejos de proteínas migran hacia el ánodo hasta llegar a su límite de tamaño de poro de tamaño dependiente. El tamaño del poro del gel de poliacrilamida depende de (i) el total acrilamida /bis– acrilamida concentración (T) y (ii) en la vinculante bis– acrilamida monómero concentración (C) en relación con los monómeros total⁴. Después de la separación con la página de la BN, los complejos de proteína pueden subdividirse aún más en sus subunidades de la proteína individual por segunda dimensión (2D) – SDS – PAGE. Aquí, describimos un protocolo detallado para el análisis de complejos de la proteína de la membrana del thylakoid por BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.