Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез
Summary
Протокол для освещения растений тилакоидных белков сложной организацией и композиция с голубой родной полиакриламида гель электрофореза (БН-страница) и описал 2D-SDS-PAGE. Протокол оптимизирован для Arabidopsis thaliana, , но может быть использован для других видов растений с незначительными изменениями.
Abstract
Фотосинтетической электрон передачи цепи (и т.д.) преобразует солнечную энергию в химическую энергию в виде АТФ и НАДФН. Четыре крупных белковых комплексов встроенный в тилакоидной мембраны урожай солнечной энергии поехать NADP+ через двух фотосистем электронов от воды, и использовать созданный протонного градиента для производства АТФ. PSII фотосистемы, PSI, цитохромы b6f (Cyt b6f) и АТФазы являются все multiprotein комплексы с различные ориентации и динамика в тилакоидной мембраны. Можно получить ценную информацию о составе и взаимодействия белковых комплексов в тилакоидной мембране, растворяющие комплексы от целостности мембраны, мягкими моющими средствами, следуют электрофоретического разделения родной гель комплексы. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является аналитический метод, используемый для разделения белковых комплексов в их родной и функциональной форме. Этот метод может использоваться для сложных очищение протеина для более детального анализа структурных, но он также предоставляет инструмент для того чтобы рассечь динамического взаимодействия между белковых комплексов. Метод был разработан для анализа митохондриальной дыхательных белковых комплексов, но с тех пор были оптимизированы и улучшены для рассечения тилакоидов белковых комплексов. Здесь мы предоставляем подробную обновленную протокол для анализа лабильной фотосинтетической белковых комплексов и их взаимодействия в проростках Arabidopsis thaliana.
Introduction
Большие multisubunit белка комплексы фотосистем PSI и PSII, Cyt b6f и АТФазы координировать производства АТФ и НАДФН в фотосинтетических реакциях свет. В высших растений хлоропластов комплексы расположены в тилакоидной мембране, который является структурно гетерогенных мембраны структурой, включающей прижаты Грана и тилакоидов стромы не прижаты. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является широко используемым методом при анализе больших multisubunit белковых комплексов в их родной и биологически активной форме. Этот метод был создан для рассечения митохондриальной мембраны белковых комплексов1, но позже был настроен для разделения белковых комплексов в тилакоидной мембраны сети3. Этот метод подходит (i) для очистки отдельных тилакоидов белковых комплексов для структурного анализа, (ii) для определения собственных взаимодействий между белковых комплексов и (iii) для анализа общей организации белковых комплексов После изменения окружающей среды подсказки.
До разделения белковых комплексов изолированы от мембраны с тщательно подобранными неионогенных моющих средств, которые, как правило, мягкая и сохранения родной структуры белковых комплексов. Моющие средства содержат гидрофобных и гидрофильных сайты и стабильные формы мицеллы выше определенной концентрации, называется критической концентрации мицеллярный (CMC). Повышение концентрации моющего средства над результатами CMC, в нарушение взаимодействия липидов липидов и солюбилизация белковых комплексов. Выбор моющего средства зависит от стабильности белкового комплекса интереса и солюбилизация количество моющего средства. Регулярно используются моющие средства включают α/β-додецил maltoside и digitonin. После солюбилизация белковых комплексов в их родном государстве нерастворимый материал удаляется путем центрифугирования. В высших растений мембрана тилакоида весьма неоднороден в структуре и некоторые моющие средства (например, digitonin) избирательно солюбилизировать последнего только конкретную часть мембраны3. Таким образом чтобы характеризовать организации сложных белков или взаимодействия между белковых комплексов, важно всегда определить мощность солюбилизация выбранного моющего средства, определяя содержание хлорофилла и хлорофилла a/b отношение супернатант для оценки урожайности и представлены тилакоид (суб) домена, соответственно, растворимых дроби. Хлорофилл a/b в нетронутыми тилакоидов роста свет акклиматизации растений составляет обычно около 3, тогда как chl / значение b тилакоидных фракций обогащенный либо в Грано или тилакоидов стромы падает ниже (~ 2.5) или превышает значение общего (~ 4.5) Тилакоиды, соответственно.
Чтобы обеспечить отрицательный заряд для белковых комплексов, Кумасси блестящий синий краситель (НБР) добавляется растворимых образца. Из-за смены заряда белковых комплексов мигрируют к аноду и отделены с уклоном акриламида (АА), по словам их молекулярной массе и форме. Эффективное и высоким разрешением разделение достигается с помощью градиента концентрации линейных акриламида. Во время электрофореза белковых комплексов мигрируют к аноду до тех пор, пока они достигают их размер зависит от размера пор предел. Размер поры геля полиакриламида зависит от (i Общая акриламида /бис– акриламид концентрация (T) и (ii) на крест-компоновщик бис– акриламид мономера концентрации (C) по отношению к общей мономеров4. После разделения с БН-страницы белковых комплексов можно далее подразделить их индивидуальных белковых субъединиц, второй измерение (2D) – SDS – PAGE. Здесь мы описываем подробный протокол для анализа тилакоидной мембраны белковых комплексов по БН-страница/2D-SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Механизм преобразования фотосинтетической энергии состоит из крупных multisubunit белковых комплексов, которые внедряются в тилакоидной мембраны. Этот протокол описывает основной метод для анализа растений тилакоидов белковых комплексов от Arabidopsis thaliana с БН-страницы в сочетании с 2D-SDS-…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было финансовой поддержке Академии Финляндии (номера проектов 307335 и 303757) и солнечной энергии биомассы (SE2B) Марии Склодовской-Кюри Грант соглашение (675006). Протокол основан на ссылка3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
