Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu
Summary
Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l’ Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.
Abstract
Chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques (etc.) convertit l’énergie solaire en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH. Quatre complexes de grandes protéines incorporées dans le thylakoïdes membrane récolte l’énergie solaire pour conduire des électrons de l’eau à NADP+ via deux photosystèmes, utilisez le gradient de protons créé pour la production d’ATP. Photosystème PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) et ATPase sont tous des complexes multiprotéiques avec orientation distincte et dynamique dans la membrane des thylakoïdes. On trouvera des informations précieuses sur la composition et les interactions entre les complexes de protéine dans la membrane des thylakoïdes par solubilisation des complexes de l’intégrité de la membrane par des détergents doux, suivies de la séparation par électrophorèse de gel natif du complexes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode d’analyse utilisée pour la séparation des complexes protéiques sous leur forme native et fonctionnelle. La méthode peut être utilisée pour la purification des protéines complexes pour l’analyse structurale plus détaillée, mais il fournit également un outil pour disséquer les interactions dynamiques entre les complexes de protéine. La méthode a été développée pour l’analyse des complexes de protéine respiratoire mitochondriale, mais depuis a été optimisée et améliorée pour la dissection des complexes protéine thylakoïdes. Ici, nous fournissons un protocole à jour détaillé pour l’analyse des complexes de protéine photosynthétique labile et leurs interactions chez Arabidopsis thaliana.
Introduction
Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b6f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes1, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau3. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.
Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane3. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.
Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu’à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis– acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis– acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total4. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) – SDS – PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les machines de conversion d’énergie photosynthétique sont composé de complexes de grandes sous-unités protéiques, qui sont incorporées dans la membrane des thylakoïdes. Ce protocole décrit une méthode de base pour l’analyse des complexes de protéine thylakoïdes plante Arabidopsis thaliana avec BN-PAGE combiné avec 2D-SDS-PAGE. Le protocole est également adapté pour l’analyse des complexes protéiques thylakoïdes des thylakoïdes du tabac et les épinards, mais pourrait nécessiter des petit…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’Académie de Finlande (numéros de projet 307335 et 303757) et l’énergie solaire dans la Convention de subvention de la biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Le protocole est basé sur la référence3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
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