Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b₆f e dell’atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L’elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell’analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della proteina complessi¹, ma più successivamente è stato personalizzato per la separazione dei complessi della proteina dalla membrana tilacoide rete³. Il metodo è adatto (i) per la purificazione dei complessi della proteina thylakoid individuali per l’analisi strutturale, (ii) per determinare interazioni natali tra complessi proteici e (iii) per l’analisi dell’organizzazione complessiva dei complessi proteici Dopo aver cambiato il stimoli ambientali.

Prima della separazione, complessi proteici sono isolati dalla membrana con detergenti non ionici attentamente selezionate, che sono generalmente lievi e preservare la struttura nativa dei complessi proteici. Detersivi contengono idrofobo e idrofilici siti e micelle stabile forma sopra una certa concentrazione, chiamato una concentrazione micellare critica (CMC). Aumento della concentrazione di detersivo sopra i risultati di CMC in rottura delle interazioni lipido-lipidico e la solubilizzazione dei complessi della proteina. La scelta di detersivo dipende sulla stabilità della proteina complessa di interesse e la capacità di solubilizzazione del detergente. Ordinariamente usati detergenti sono α/β-dodecil-maltoside e digitonina. La solubilizzazione dei complessi della proteina nel loro stato nativo, materiale insolubile viene rimosso mediante centrifugazione. Nelle piante superiori, la membrana tilacoide è altamente eterogeneo in struttura e alcuni detersivi (ad es., digitonina) solubilizzano selettivamente solo una specifica frazione della membrana³. Pertanto, per caratterizzare l’organizzazione complessa di proteine o le interazioni tra i complessi di proteine, è cruciale determinare sempre la capacità di solubilizzazione del detergente scelto attraverso la determinazione del contenuto di clorofilla e la clorofilla a/b rapporto del surnatante per valutare il rendimento e il dominio rappresentato thylakoid (sub), rispettivamente, della frazione solubilizzata. Il rapporto di clorofilla a/b in tilacoidi intatto di crescita-luce acclimatati piante è in genere intorno alle 3, mentre il chl un / valore b di thylakoid frazioni arricchite in grana o stroma tilacoidi scende di sotto (~ 2,5) o superiore (~ 4,5) al valore del totale tilacoidi, rispettivamente.

Per fornire la carica negativa per i complessi di proteine, colorante (CBB) azzurro brillante di Coomassie è aggiunto al campione solubilizzato. A causa dello spostamento di carica, complessi proteici migrano verso l’anodo e sono separati su una pendenza di acrilamide (AA) secondo la loro forma e la massa molecolare. Separazione efficace e ad alta risoluzione si ottiene utilizzando un gradiente di concentrazione di acrilammide lineare. Durante l’elettroforesi, i complessi di proteine migrano verso l’anodo fino a quando essi raggiungono il loro limite di dimensione dei pori dipendente dalla dimensione. Il formato del poro del gel di poliacrilammide dipende da (i) il totale acrilammide /bis– acrilammide concentrazione (T) e (ii) il cross-linker bis– acrilammide monomero concentrazione (C) riguardante i monomeri totale⁴. Dopo la separazione con BN-PAGE, i complessi di proteine possono essere ulteriormente suddivisi in loro subunità proteiche individuali di seconda dimensione (2D) – SDS – PAGE. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’analisi di complessi di proteine di membrana tilacoide da BN-pagina/2D-SDS-PAGE.