蓝色本机凝胶电泳法分析囊体膜蛋白配合物
Summary
本文介绍了用蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 和2维 SDS 页对植物囊体蛋白复合组织和成分进行澄清的一种协议。该协议是对拟南芥的优化, 但可以用于其他植物物种的小修改。
Abstract
光合电子传递链 (等) 将太阳能转化为化学能和 ATP 的形式。四大蛋白复合物嵌入囊体膜收获太阳能, 以驱动电子从水到 NADP+ 通过两个-高等植物, 并使用创建的质子梯度生产 ATP。光系统 ii PSII, PSI, 细胞色素 b6f (Cyt b6f) 和 atp 酶是所有复合配合物, 具有明显的方向和动力学在囊体膜。用温和洗涤剂将复合物从膜的完整性中溶出, 然后用本机凝胶电泳分离, 可获得有关类囊体膜中蛋白质复合物组成和相互作用的宝贵信息。配合 物。蓝色本机聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种分析方法, 用于分离蛋白质复合物在其本机和功能形式。该方法可用于蛋白质复合纯化, 更详细的结构分析, 但也提供了一种解剖蛋白质复合物间动态相互作用的工具。该方法是为分析线粒体呼吸蛋白复合物而开发的, 但从那时起对囊体蛋白复合物的解剖进行了优化和改进。在此, 我们提供了一个详细的最新的协议, 以分析不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用的拟南芥。
Introduction
大 multisubunit 蛋白配合物光系统 ii PSI 和 PSII, Cyt b6f 和 atp 酶在光合光反应中协调和 atp 的生产。在高等植物叶绿体中, 复合物位于类囊体膜中, 它是一种结构上的异质膜结构, 包括贴伏粒和非贴伏基质类囊体。蓝原体聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种广泛应用的方法, 用于分析大型 multisubunit 蛋白复合物的原生和生物活性形态。建立了线粒体膜蛋白配合物1的解剖方法, 但后来又自定义为分离出囊体膜网络3的蛋白质复合物。该方法适用于 (i) 纯化单个囊体蛋白复合物进行结构分析, (ii) 确定蛋白质复合体之间的本机相互作用和 (iii) 分析蛋白质复合物的整体组织在变化的环境线索。
在分离之前, 蛋白质复合体是从膜中分离出来的, 经过精心挑选的非离子洗涤剂, 一般都是温和的, 保存着蛋白质复合体的原生结构。洗涤剂含有疏水性和亲水性的场所, 形成稳定的胶束在一定浓度之上, 称为临界胶束浓度 (CMC)。增加在 CMC 以上的洗涤剂浓度, 导致脂质脂相互作用的破坏和蛋白质复合物的增溶。洗涤剂的选择取决于感兴趣的蛋白质复合体的稳定性和洗涤剂的增溶能力。常规使用的洗涤剂包括α/β-月桂-maltoside 和 digitonin。随着蛋白质复合物在其原生状态下的溶解, 不溶性物质被离心去除。在高等植物中, 囊体膜在结构上高度异, 某些洗涤剂 (如digitonin) 选择性地溶解了膜3的特定部分。因此, 要确定蛋白质复合组织的特征或蛋白质复合物之间的相互作用, 必须通过确定叶绿素含量和叶绿素 a/b 来测定所选洗涤剂的增溶能力。上清比对可溶性分数的产量和所代表的囊体 (子) 域分别进行评估。生长光驯化植物完整类囊体中叶绿素 a/b 的比值通常在3左右, 而在粒或基质中富集的类囊体分数的值低于 (~ 2.5) 或超过 (~ 4.5) 总的值类囊体, 分别。
为了向蛋白质复合体提供负电荷, 考马斯蓝 (CBB) 染料添加到可溶性样品中。由于电荷转移, 蛋白质复合物向阳极迁移, 并根据分子质量和形状在丙烯酰胺 (AA) 梯度上分离。采用线性丙烯酰胺浓度梯度, 实现了高效、高分辨率分离。在电泳过程中, 蛋白质复合体向阳极迁移, 直到达到其大小依赖性的孔隙大小限制。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于 (i) 总丙烯酰胺/双丙烯酰胺浓度 (T) 和 (ii) 对交叉连接器双丙烯酰胺单体浓度 (C) 相对于总单体4。与 BN 页分离后, 蛋白质复合物可进一步细分为各自的蛋白质亚基, 第二维 (2 d)-SDS 页。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以分析的囊状体膜蛋白配合物的 BN-PAGE/2D-SDS-PAGE。
Protocol
Representative Results
Discussion
光合能量转换机械由大型 multisubunit 蛋白复合物组成, 嵌在囊体膜中。该协议描述了一个基本的方法来分析的植物囊体蛋白复合物从拟南芥与 2 d-SDS 页结合。该协议也适用于分析烟草和菠菜类囊体类囊体蛋白复合物, 但可能需要小的调整。
对于膜蛋白复合物的增溶, 非离子洗涤剂通常用于保存其原生形式的复合物的能力。这里使用了两种常用的洗涤剂β DM 和 digitonin。月?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了芬兰科学院 (项目编号307335和 303757) 和太阳能成生物量 (SE2B) 玛丽居里夫人-居里赠款协议 (675006) 的资助。该协议基于参考3。
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
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