Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b₆f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos¹, mas mais tarde foi personalizado para a separação dos complexos da proteína da membrana tilacoides rede³. O método é adequado (i) para a purificação de complexos de proteínas tilacoides individuais para análise estrutural, (ii) para determinar o nativas interações entre complexos de proteína e (iii) a análise da organização geral dos complexos da proteína Após alterar as sugestões ambientais.

Antes da separação, complexos da proteína são isolados da membrana com detergentes não iônicos cuidadosamente escolhidos, que são geralmente leves e preservar a estrutura nativa dos complexos da proteína. Detergentes contêm hidrofóbicos e hidrofílicos sites e micelas estável de forma acima de uma determinada concentração, chamado uma concentração crítica de micellar (CMC). Aumentando a concentração de detergente acima dos resultados CMC no rompimento das interações lipid-lipídico e a solubilização dos complexos da proteína. A escolha do detergente depende a estabilidade da proteína complexa de interesse e a capacidade de solubilização de detergente. Rotineiramente utilizados detergentes incluem α/β-dodecil-maltoside e digitonin. Após a solubilização dos complexos de proteína no seu estado nativo, material insolúvel é removido por centrifugação. Em plantas superiores, a membrana tilacoides é altamente heterogêneo em estrutura e alguns detergentes (por exemplo, digitonin) solubilizar seletivamente apenas uma fração específica da membrana³. Portanto, para caracterizar as interações entre os complexos de proteína ou proteína complexa organização, é crucial determinar sempre a capacidade de solubilização de detergente escolhido, determinando-se o teor de clorofila e a clorofila a/b relação de sobrenadante para avaliar o rendimento e o domínio representado tilacoides (sub), respectivamente, da fração solubilized. A clorofila a/b relação contém intacta de crescimento-luz acclimated plantas normalmente é em torno de 3, Considerando que a chl um / b valor de tilacoides frações enriquecidas em grana ou estroma contém cai abaixo (~ 2.5) ou superior (~ 4,5) o valor do total contém, respectivamente.

Para fornecer uma carga negativa para os complexos de proteína, a tintura de (CBB) azul brilhante de Coomassie é adicionada à amostra solubilized. Devido a mudança de carga, complexos de proteínas migram para o ânodo e são separados em um gradiente de acrilamida (AA) de acordo com sua massa molecular e a forma. Separação eficaz e de alta resolução é conseguida usando um gradiente de concentração de acrilamida linear. Durante a eletroforese, os complexos de proteína migram para o ânodo até atingirem o limite de tamanho de poro dependente do tamanho. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide depende (i) a acrilamida total /bis– acrilamida concentração (T) e (ii) sobre a cross-linker bis– acrilamida monômero concentração (C) em relação a monômeros total⁴. Após a separação com BN-página, os complexos de proteína podem ser subdivididos em suas subunidades de proteínas individuais por segunda dimensão (2D) – SDS – PAGE. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por BN-página/2D-SDS-PAGE.