Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese
Summary
Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.
Abstract
Photosynthetische Electron Transfer Kette (usw.) wandelt Sonnenenergie in chemische Energie in Form von NADPH und ATP. Vier große Proteinkomplexe eingebettet in die Thylakoidmembran Membran Ernte Solarenergie Elektronen aus dem Wasser auf NADP+ über zwei photosysteme zu fahren, und die erstellten Proton Steigung für Produktion von ATP. Photosystem PSII, PSI, Cytochrom b6f (Cyt b6d) und ATPase sind alle Multi-komplexe mit eindeutigen Ausrichtung und Dynamik in der Thylakoidmembran Membran. Wertvolle Informationen über die Zusammensetzung und die Interaktionen der Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran Membran erhalten Sie durch Gefäss-komplexe aus der Membran Integrität von Feinwaschmittel gefolgt von native Gel elektrophoretische Trennung von der -komplexe. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine analytische Methode für die Trennung der Proteinkomplexe in ihrer nativen und funktionale Form verwendet. Die Methode eignet sich für komplexe Proteinreinigung für genauere strukturelle Analyse, sondern es bietet auch ein Werkzeug, um die dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu sezieren. Die Methode wurde entwickelt für die Analyse der mitochondrialen Atmung Proteinkomplexe, aber seitdem optimiert und verbessert für die Zerlegung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll auf dem neuesten Stand für die Analyse der labile photosynthetischen Proteinkomplexe und ihrer Wechselwirkungen in Arabidopsis Thaliana.
Introduction
Großen speziellen Protein-komplexe Photosystem PSI und PSII, Cyt b6f und ATPase koordinieren die Herstellung von NADPH und ATP in photosynthetischen Licht Reaktionen. In höheren Pflanzen Chloroplasten die komplexe in der Thylakoidmembran Membran befinden sich ein strukturell heterogenen Membran-Struktur, bestehend aus anliegenden Grana und nicht anliegenden Stroma Thylakoids. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine extensiv genutzte Methode bei der Analyse von großen speziellen Proteinkomplexe in ihrer nativen und biologisch aktive Form. Die Methode wurde für die Zerlegung des Mitochondrien-Membran-Protein-komplexe1, aber später für die Trennung von Proteinkomplexen aus der Thylakoidmembran Membran Netzwerk3angepasst wurde. Die Methode eignet sich (i) für die Reinigung der einzelnen Thylakoidmembran Proteinkomplexe für Baustatik, (Ii) zur Bestimmung der native Interaktionen zwischen Proteinkomplexe und (Iii) für die Analyse der Gesamtorganisation der Proteinkomplexe nach dem ändern ökologische Hinweise.
Vor der Trennung sind Proteinkomplexe isoliert von der Membrane mit sorgfältig ausgewählten nichtionische Reinigungsmitteln, die in der Regel mild und bewahren die native Struktur der Protein-komplexe. Waschmittel enthalten hydrophoben und hydrophilen Seiten und Form stabilen Micellen ab einer gewissen Konzentration genannt eine kritische Mizellen Konzentration (CMC). Erhöhung der Waschmittel Konzentration über den CMC-Ergebnissen in Störungen der Lipid-Lipid-Interaktionen und die Solubilisierung von Proteinkomplexen. Die Wahl des Waschmittels hängt von der Stabilität des Proteins von Interesse und die Solubilisierung Kapazität des Waschmittels. Routinemäßig verwendeten Reinigungsmittel sind α/β-Dodecyl-maltosid und Digitonin. Im Anschluss an die Solubilisierung Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand wird unlöslichen Material durch Zentrifugieren entfernt. In höheren Pflanzen die Thylakoidmembran Membran ist sehr heterogene Struktur und einige Reinigungsmittel (z. B. Digitonin) anderweitig selektiv nur einen bestimmten Bruchteil der Membran3. Um die Protein-komplexe Organisation oder die Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu charakterisieren, ist es daher entscheidend, die Solubilisierung Kapazität des gewählten Waschmittels bestimmen Sie immer durch die Bestimmung der Chlorophyllgehalt und Chlorophyll A/b Verhältnis der überstand den Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran (Sub) Domain bzw. der solubilized Fraktion bewerten. Das Chlorophyll A/b-Verhältnis in intakten Thylakoids Wachstum-Licht gewöhnt Pflanzen ist in der Regel etwa 3, während die Chl ein / b-Wert der Thylakoidmembran Fraktionen bereichert entweder in Grana oder Stroma Thylakoids (~ 2,5) unterschreitet oder überschreitet (~ 4,5) den Wert des gesamten Thylakoids, beziehungsweise.
Um negative Ladung, die Proteinkomplexe zu bieten, wird die solubilized Beispiels Coomassie brillianter blau (CBB) Farbstoff hinzugefügt. Durch die Verschiebung kostenlos Proteinkomplexe in Richtung Anode Wandern und auf einer Steigung von Acrylamid (AA) entsprechend ihrer molekularen Masse und Form getrennt sind. Effektive und hochauflösende Trennung wird mithilfe einer linearen Acrylamid Konzentration Steigung erreicht. Während der Elektrophorese Wandern die Proteinkomplexe in Richtung der Anode bis sie ihre größenabhängige Porengröße Grenze erreichen. Die Porengröße der Polyacrylamid-Gel hängt (i) die gesamte Acrylamid /BIZAcrylamid – Konzentration (T) und (Ii) auf den Vernetzer bis– Acrylamid monomerkonzentration (C) im Verhältnis zu den gesamten Monomere4. Nach der Trennung mit BN-Seite können die Proteinkomplexe weiter durch die zweite Dimension (2D) – SDS – PAGE in ihre einzelnen Protein-Untereinheiten unterteilt werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch BN-Seite/2D-SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die photosynthetische Energie Umwandlung Maschinen besteht aus großen speziellen Proteinkomplexe, die in die Thylakoidmembran Membran eingebettet sind. Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Analyse der Pflanze Thylakoidmembran Proteinkomplexe von Arabidopsis Thaliana mit BN-Seite zusammen mit 2D-SDS-PAGE. Das Protokoll eignet sich auch für die Analyse der Thylakoidmembran Proteinkomplexe aus Tabak und Spinat Thylakoids, aber kleine Anpassungen erfordern.
Für die…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Academy of Finland (Projekt-Nummern 307335 und 303757) und Sonnenenergie in Biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung (675006) finanziell unterstützt. Das Protokoll basiert auf Referenz3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
