Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores
Summary
Ett protokoll för förtydligandet av växten tylakoida protein komplex organisation och sammansättning med blå infödda polyakrylamid gel elektrofores (BN-sidan) och 2D-SDS-PAGE beskrivs. Protokollet är optimerad för Arabidopsis thaliana, men kan användas för andra växtarter med smärre ändringar.
Abstract
Fotosyntetiska elektron överföringen kedjan (ETC) omvandlar solenergi till kemisk energi i form av NADPH och ATP. Fyra stora proteinkomplex inbäddad i den tylakoida membran skörd solenergin att köra elektroner från vatten till NADP+ via två fotosystem och använda den skapade Protonlutning för produktion av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) och ATPas är alla multiprotein komplex med distinkta orientering och dynamiken i tylakoida membran. Värdefull information om sammansättning och interaktioner av proteinkomplex i tylakoida membran kan erhållas genom solubilizing komplex från membran integriteten av milda tvättmedel följt av infödda gel elektroforetisk separation av de komplex. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en analysmetod som används för separation av proteinkomplex i deras infödda och funktionell form. Metoden kan användas för protein komplex rening för mer detaljerad strukturanalys, men det ger också ett verktyg för att dissekera dynamiska samspelet mellan proteinkomplex. Metoden har utvecklades för analys av mitokondrie respiratoriska proteinkomplex, men sedan dess optimerad och förbättrats för dissekering av tylakoida proteinkomplex. Här ger vi en detaljerad aktuell protokoll för analys av labila fotosyntetiska proteinkomplex och deras interaktioner i Arabidopsis thaliana.
Introduction
Stora multisubunit protein komplex fotosystem PSI och PSII, Cyt b6f och ATPas samordna produktionen av NADPH och ATP i fotosyntetiska ljus reaktioner. I högre växt kloroplaster, är komplexen belägna i det tylakoida membranet, som är en strukturellt heterogena membranstruktur, bestående av appressed grana och icke-appressed stroma thylakoids. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en omfattande metod i analysen av stora multisubunit proteinkomplex i deras infödda och biologiskt aktiva form. Metoden var etablerat för dissektion av mitokondriella membranet protein komplex1, men senare har anpassats för separation av proteinkomplex från tylakoida membran nätverk3. Metoden är lämplig för rening av enskilda tylakoida proteinkomplex för strukturanalys, (ii) för att fastställa infödd interaktioner mellan proteinkomplex och (iii) för analys av övergripande organisation av proteinkomplex vid förändras miljön ledtrådar.
Innan separationen är proteinkomplex isolerade från membranet med noga utvalda Nonjonaktivt rengöringsmedel, som är vanligtvis milda och bevara den ursprungliga strukturen av proteinkomplex. Tvättmedel innehåller hydrofoba och hydrofil platser och bildar stabila miceller över en viss koncentration, kallas en kritisk micellar koncentration (CMC). Ökar den tvättmedel koncentrationen över CMC resultaten i störningar av lipid-lipid interaktioner och lösbarhet av proteinkomplex. Valet av tvättmedel beror på stabiliteten av protein komplex av intresse och lösbarhet kapacitet av tvättmedel. Rutinmässigt används rengöringsmedel inkluderar α/β-dodecyl-maltoside och digitonin. Efter lösbarhet av proteinkomplex i sitt ursprungliga tillstånd, olösligt material tas bort genom centrifugering. I högre växter, tylakoida membranet är mycket heterogen struktur och vissa rengöringsmedel (t.ex. digitonin) solubilize selektivt bara en specifik del av membran3. För att karakterisera den protein komplex organisationen eller samspelet mellan proteinkomplex, är det därför avgörande att alltid bestämma lösbarhet kapaciteten av det valda tvättmedlet genom att bestämma halten klorofyll och klorofyll a/b förhållandet av supernatanten att bedöma avkastningen och den föreställda tylakoida (sub) domänen, respektive av den solubilized fraktionen. Klorofyll a/b förhållandet i intakt thylakoids av tillväxt-ljus acklimatiserad växter är vanligen omkring 3, medan chl en / b värdet av tylakoida fraktioner berikad antingen i grana eller stroma thylakoids understiger (~ 2,5) eller överskrider (~ 4.5) värdet av totalen thylakoids, respektive.
För att ge negativ laddning till proteinkomplex, tillsätts Coomassie brilliant blue (CBB) färgämne solubilized provet. På grund av kostnad skiftet, proteinkomplex migrera mot anoden och separeras på en akrylamid (AA) lutning enligt deras molekylärt samlas och form. Effektiv och högupplösta separation uppnås med hjälp av en linjär akrylamid koncentrationsgradient. Under elektrofores migrera proteinkomplex mot anoden tills de når sin storlek-beroende porstorlek gräns. Polyakrylamidgelen por-storlek beror på (i) den totala akrylamid /bis– akrylamid koncentration (T) och (ii) på cross-linker bis– akrylamid monomer koncentrationen (C) i förhållande till den totala monomerer4. Efter separationen med BN-sida, kan proteinkomplex ytterligare delas in i deras individuella proteinsubenheter med andra-dimension (2D) – SDS – PAGE. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för analys av tylakoida membran proteinkomplex av BN-/ 2D SDS sida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotosyntetiska energi konvertering maskiner består av stora multisubunit proteinkomplex, som är inbäddade i membranet som tylakoida. Det här protokollet beskriver en grundläggande metod för analys av de växt tylakoida proteinkomplex från Arabidopsis thaliana med BN-sida kombinerat med 2D-SDS-PAGE. Protokollet är också lämplig för analys av tylakoida proteinkomplex från tobak och spenat thylakoids, men kan kräva små justeringar.
För lösbarhet av membran proteinkomplex …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes ekonomiskt av Finlands Akademi (projektnummer 307335 och 303757) och solenergi i biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie bidragsavtalet (675006). Protokollet är baserat på referens3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Referencias
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
