Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione biochimica dell’enzima modificante la RNA lievito, Mod5 e discutere come questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri enzimi modificanti la RNA.
N6– isopentenyladenosine RNA modifiche sono funzionalmente diversi e altamente conservata tra procarioti ed eucarioti. Una delle più altamente conservato N6– isopentenyladenosine modifiche si verifica la posizione A37 in un sottoinsieme di tRNA. Questa modifica migliora l’efficienza della traduzione e fedeltà aumentando l’affinità del tRNA per il ribosoma. Mutazione di enzimi responsabili di questa modifica negli eucarioti sono associate a diversi Stati di malattia, compreso cancro e la disfunzione mitocondriale. Pertanto, comprendere la specificità di substrato e attività biochimiche di questi enzimi è importante per la comprensione della biologia eucariotica normale e patologica. Una vasta gamma di metodi è stata impiegata per caratterizzare i6A modificazioni. Qui è descritto un approccio diretto per la rilevazione di isopentenylation di Mod5. Questo metodo utilizza l’incubazione di RNA con una transferasi di isopentenyl ricombinante, seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per individuare i6A modifiche. Inoltre, il potenziale adattabilità di questo protocollo per la caratterizzazione di altri enzimi modificanti la RNA è discussa.
Modifiche RNA almeno 163 posttranscriptional distinte sono state identificate, con queste modifiche che conferisce funzioni diverse e dipendente dal contesto di RNAs, direttamente che influenzano la struttura di RNA e che interessano interazioni di RNA con altri molecole1,2. L’apprezzamento per il numero e la varietà di RNA modifiche aumenta, è fondamentale per sviluppare le analisi che possono interrogare in modo affidabile sia le modifiche di RNA e gli enzimi che catalizzano loro.
Si verifica una delle prime modifiche di RNA di essere identificato a base 37 in tRNAs, adiacente al anti-codone3,di lato per 3′4. Un gruppo di isopentenyl viene trasferito da dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) nella posizione di N6 di adenosina 37 (ho6A37) 3,5 su un sottoinsieme di tRNAs sia citoplasmiche e mitocondriali. Ho6A37 migliora la fedeltà di traduzione ed efficienza aumentando affinità di tRNA per il ribosoma4,6 e ho6A37 è importante per la risposta allo stress in batteri7. Gli enzimi che eseguire questa modifica sono definiti transferasi isopentenyl tRNA e sono altamente conservati in batteri8,9, funghi10, vermi11, piante12e più alti eucarioti13 , compreso gli esseri umani14.
Mutazioni nel gene umano di tRNA isopentenyl transferasi, TRIT1, sono associate con la malattia umana. Ad esempio, una mutazione in TRIT1 è correlata con una grave malattia mitocondriale, probabilmente causata da un difetto nella sintesi proteica mitocondriale15,16. Inoltre, TRIT1 è stato descritto come un tumore soppressore gene17,18 ed è implicata in parecchi tipi di cancri, compreso il melanoma19, seno20, gastrico21e cancri polmonari22 ,23. Infine, TRIT1 e Mod5 transferasi isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) sono soggette a aggregazione proteine che formano il prione-come le fibre amiloidi24,25,26. Queste osservazioni implicano potenzialmente transferasi di isopentenyl tRNA nelle malattie neurodegenerative, anche se la prova diretta per questa non è ancora stata dimostrata.
Dato il ruolo che isopentenyl transferasi giocare nella traduzione e nella malattia, metodi che misurano direttamente i6un’attività della transferasi di isopentenyl sono importanti per una comprensione meccanicistica di questi enzimi normali e Stati di malattia. Un crescente numero di metodi è disponibile per individuare i modifiche di RNA A6, compreso in vitro isopentenylation saggi, l’ibridazione positiva in assenza di i6saggi un (PHA6), cromatografia su strato (TLC), aminoacido di sottile analisi di attività di accettazione e approcci di spettrometria di massa (rivisto in rif. 4).
Un’analisi di isopentenylation in vitro è stato descritto che utilizza 14C-DMAPP e tRNAs senza etichetta. In questo saggio, carbonio radioattivo viene trasferito al RNA dal 14C-DMAPP mediante la transferasi di isopentenyl. Mentre questo test è altamente sensibile, è spesso difficile determinare il residuo specifico che è modificato9,20,27. Saggi PHA6 contare su una pesante modifica6A interferire con l’ibridazione di una 32P-labeled sonda che abbracciano il residuo modificato. Come tale, l’ibridazione è maggiore in assenza di una i6una modificazione18,28,29. PHA6 le analisi sono altamente sensibili e in grado di analizzare il RNA totale Estratto da lisati cellulari. Inoltre, la capacità di progettare le sonde specifiche per il RNA di interesse dà tutto questo metodo obiettivo sostanziale. Tuttavia, PHA6 saggi sono limitati alla caratterizzazione delle modificazioni che si verificano sui residui all’interno della regione di destinazione della sonda e pertanto sono meno propensi a identificare nuovi modifica siti. Inoltre, come assenza di associazione è indicativo di modificazione, altre modifiche o mutazioni che influenzano il legame al RNA saranno confondere l’analisi dei dati.
Un altro approccio combina cromatografia di cellulosa di benzile DEAE cellulosa (BD) con attività di accettazione dell’aminoacido come una lettura di i6A modifiche nel tRNA30. Questo approccio di analisi direttamente la funzione di i6A modifiche, ma è un approccio indiretto per individuare i6A modificazione e manca di risoluzione per mappare le modifiche ad un residuo specifico nel RNA. Un approccio di TLC è stato utilizzato per rilevare il tRNA totale ho6A modifiche. In questo approccio, internamente 32P-labeled tRNAs sono digeriti a singoli nucleotidi e analisi TLC bidimensionale viene utilizzato per identificare isopentenylation. Questo approccio è altamente sensibile nella rilevazione totale ho6A in un dato campione di RNA ma sulla digestione, tutte le informazioni di sequenza sono perse; così, l’investigatore non ha modo di determinare quali residui sono stati modificati31.
Più recentemente, sono stati sviluppati metodi liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che confronta quantitativamente le modifiche di RNA totale tra specie, tipi di cellule e condizioni sperimentali32,33, 34. Una limitazione di questa metodologia è che è meno in grado di determinare l’identità e la posizione all’interno di RNA da cui i nucleosidi modificati è stato derivato34. Inoltre, le competenze e le attrezzature necessarie per eseguire questi esperimenti limitare la praticità di questo approccio.
Inoltre, diverse tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono stati sviluppati per mappare RNA modifiche transcriptome livello34. Immunoprecipitazione di RNA con anticorpi specifici per una particolare modifica (RIP-Seq) permettono al ricercatore di identificare tutte le sequenze che contengono una modifica specifica35,36. Inoltre, gli approcci basati su trascrittasi inversa come sequenza di mancata corrispondenza non casuale e Chem-Seq si basano su perturbazioni della reazione di trascrizione inversa al residui modificate37,38,39. Nonostante il vantaggio di queste tecniche per mappare tutto il RNA modifiche del trascrittoma, RIP-seq e Chem-Seq tecnologie sono limitati dalla mancanza di anticorpi affidabili o sostanze chimiche reattive disponibili per ogni modifica specifica, rispettivamente34. Inoltre, gli enzimi trascrittasi inversa necessari per eseguire Chem-Seq e tecniche di sequenziamento di mancata corrispondenza non casuale possono essere ostacolate da strutture stabili di RNA. La natura altamente modificata e strutturalmente stabile di tRNAs li rendono particolarmente difficile interrogare usando queste tecniche. Ad oggi, tecnologie basate su sequenziamento di nuova generazione ancora non sono state utilizzate per mappare i6un modifiche34.
Qui, descriviamo un approccio semplice e diretto per individuare i6A tRNA modifiche in vitro. Questo metodo utilizza l’incubazione di RNA con ricombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasi (Mod5), seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per mappare i6A modifiche. Questo approccio è diretto e richiede competenze poco specializzata per analizzare i dati. Inoltre, questo metodo è adattabile ad altri RNA modificando gli enzimi, compreso gli enzimi che modificano covalentemente il peso molecolare di RNA o di mobilità di un RNA attraverso un gel.
Modifiche di RNA continuano ad essere mostrato ai giocano un ruolo sempre più importante e diversificata in funzione cellulare e organismica. Come tale, lo sviluppo di saggi per interrogare RNA modificando gli enzimi è fondamentale per comprendere meglio gli aspetti fondamentali della biologia. Questo protocollo descrive un’analisi ad alta risoluzione in vitro per caratterizzare l’attività di modifica di tRNA di Mod5.
Questo protocollo ha il vantaggio di fornire una lettura diretta…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il Dr. David Engelke per sua guida e utili commenti su questo manoscritto. PJS – fondi di avvio laboratorio Ball State University; DAB – concedere 1R15AI130950-01.
Reagents | |||
UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
Equipment and Supplies | |||
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
Plastic wrap | (local grocery store) |