تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

وقد حددت 163 على الأقل تعديلات الحمض النووي الريبي بوسترانسكريبشونال متميزة، مع هذه التعديلات إسناد مهام متنوعة وتعتمد على السياق للكشف، والتأثير على بنية الحمض النووي الريبي مباشرة، والتي تؤثر على التفاعلات من الجيش الملكي النيبالي مع الآخر جزيئات^1،2. كما يزيد من تقدير لعدد ومتنوعة من الحمض النووي الريبي التعديلات، من الضروري تطوير فحوصات يمكن استجواب موثوق بالتعديلات الجيش الملكي النيبالي والأنزيمات التي تحفيز لهم.

واحدة من أول التعديلات الحمض النووي الريبي تحديد يحدث في قاعدة 37 في ترنس، المتاخمة كودون المضادة على^3،4الجانب 3 ‘. يتم نقل مجموعة إيسوبينتينيل من ديميثيلاليلبيروفوسفاتي (دماب) إلى موقف N6 الادينوسين 37 (أنا⁶A37) ^3،5 على مجموعة فرعية ترناس هيولى والميتوكوندريا على حد سواء. أنا⁶A37 يحسن الترجمة الإخلاص والكفاءة بزيادة تقارب للحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم^4،6 ، ومن⁶A37 مهم لإجهاد استجابة في البكتيريا⁷. الإنزيمات التي تقوم بهذا التعديل يسمى الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس وهي شديدة المحافظة في البكتيريا^8،9والفطريات¹⁰،¹¹من الديدان، النباتات¹²وأعلى حقيقيات النوى¹³ ، بما في ذلك البشر¹⁴.

الطفرات في الإنسان الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراز الجينات، TRIT1، المرتبطة بالأمراض التي تصيب البشر. على سبيل المثال، يرتبط بطفرة في TRIT1 مع مرض المتقدرية شديدة، ناجمة على الأرجح عن خلل في البروتين المتقدرية توليف^15،16. وعلاوة على ذلك، وصفت بأنها ورم المكثف جينات^17،18 TRIT1 وتورط في عدة أنواع من السرطان بما في ذلك سرطان الجلد¹⁹،²⁰من الثدي و المعدة²¹وسرطانات الرئة^{22 ،23}. وأخيراً، TRIT1 و Mod5 ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل (Saccharomyces cerevisiae) هي المعرضة لتجميع البروتينات التي تشكل ألياف اميلويد مثل بريون^24،،من²⁵²⁶. يحتمل أن تكون هذه الملاحظات توريط الحمض الريبي النووي النقال إيسوبينتينيل ترانسفيراسيس في أمراض الأعصاب، على الرغم من أن الأدلة المباشرة لهذا لم تظهر بعد.

نظراً للدور الذي تؤديه ترانسفيراسيس إيسوبينتينيل في الترجمة، والمرض، وأساليب مباشرة قياس مدى⁶نشاطا ترانسفيراز إيسوبينتينيل هي هامة لفهم ميكانيكية لهذه الإنزيمات تحت العادي والحالات المرضية. عدد متزايد من أساليب متوفرة للكشف عن أنا⁶“الجيش الملكي النيبالي” التعديلات، بما في ذلك في المختبر فحوصات إيسوبينتينيلاتيون، التهجين إيجابية في غياب أنا رقيقة⁶فحوصات (PHA6)، طبقة اللوني (TLC)، الأحماض الأمينية قبول النشاط فحوصات، والنهج الكتلي (المراجعة في الرقم ⁴).

لقد وصفت الإنزيم إيسوبينتينيليشن في المختبر يستخدم ¹⁴ج-DMAPP وترنس غير مسمى. في هذا التحليل، يتم نقل الكربون المشعة للجيش الملكي النيبالي من ¹⁴ج-دماب من ترانسفيراز إيسوبينتينيل. أثناء هذا الفحص حساس بدرجة كبيرة، من الصعب غالباً تحديد بقايا المحددة التي يتم تعديل^9،،من²⁰²⁷. فحوصات PHA6 تعتمد على ضخمة أنا التعديل⁶بالتدخل مع التهجين التحقيق المسمى ف ³²تمتد بقايا تم التعديل. على هذا النحو، أكبر في غياب أنا التهجين⁶تعديل^18،،من²⁸²⁹. فحوصات PHA6 حساسة للغاية، وقادرة على تحليل الحمض النووي الريبي الإجمالية المستخرجة من ليساتيس الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يعطي القدرة على تصميم المجسات الخاصة بالجيش الملكي النيبالي لمصلحة هذه المرونة هدفا كبيرا في الأسلوب. ومع ذلك، تقتصر فحوصات PHA6 وصف التعديلات التي تحدث على بقايا داخل المنطقة المستهدفة من التحقيق وذلك هي أقل احتمالاً لتحديد مواقع تعديل رواية. وباﻹضافة إلى ذلك، كما غياب الربط إرشادي للتعديل، التعديلات أو الطفرات التي تؤثر على الحمض النووي الريبي ملزمة أخرى سوف يتيه تحليل البيانات.

نهج آخر يجمع البنزيل دي السليلوز (دينار بحريني) السليلوز اللوني مع الأحماض الأمينية قبول النشاط كقراءات أنا التعديلات⁶A في الحمض الريبي النووي النقال³⁰. هذا النهج مباشرة فحوصات الوظيفة أنا التعديل⁶A، ولكن هو نهج غير مباشرة للكشف عن أنا التعديل⁶A ويفتقر إلى قرار لتعيين إدخال تعديلات على رواسب محددة في الجيش الملكي النيبالي. وقد استخدمت نهج TLC للكشف عن مجموع الحمض الريبي النووي النقال أنا التعديلات⁶A. في هذا النهج، داخليا يتم هضمها ³²ترنس المسمى ف إلى النيوكليوتيدات واحدة ويستخدم ثنائي الأبعاد TLC التحليل لتحديد إيسوبينتينيليشن. وهذا النهج حساسة للغاية في الكشف عن مجموع أولاً⁶A في عينة الحمض النووي الريبي معين ولكن عند الهضم، كل تسلسل المعلومات المفقودة؛ وهكذا، المحقق على أي طريقة من تحديد أي بقايا تم تعديل³¹.

في الآونة الأخيرة، أساليب السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) قد وضعت الكمية مقارنة مجموع التعديلات الحمض النووي الريبي بين الأنواع، أنواع الخلايا، وظروف تجريبية^{32،33، 34}. حد من هذه المنهجية هو أنها أقل قدرة على تحديد هوية والموقف داخل الجيش الملكي النيبالي الذي كان نوكليوزيد المعدلة المستمدة³⁴. وعلاوة على ذلك، بالخبرة الفنية والمعدات اللازمة لتنفيذ هذه التجارب تحد من إمكانية التطبيق العملي لهذا النهج.

وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت العديد من تقنيات الجيل التالي التسلسل لخريطة الحمض النووي الريبي تعديلات على نطاق الترنسكربيتوم³⁴. إيمونوبريسيبيتيشن من الكشف مع الأجسام المضادة المحددة لتعديل معين (RIP-Seq) تمكين المحقق لتحديد تسلسل كل تحتوي على^35،تعديل محددة³⁶. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد النهج المستندة إلى المنتسخة العكسية مثل Seq تشيم وتسلسل عدم تطابق غير عشوائية على الاضطرابات من رد فعل النسخ العكسي في^38،،من³⁷بقايا تم التعديل³⁹. على الرغم من الاستفادة من هذه التقنيات خريطة الحمض النووي الريبي التعديلات الترنسكربيتوم المنظومة، seq التمزق وتكنولوجيات Seq تشيم مقيدة بعدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها أو المواد الكيميائية المتفاعلة متاحة لكل تعديل محددة، على التوالي³⁴. وعلاوة على ذلك، الإنزيمات المنتسخة العكسية المطلوبة لأداء Seq تشيم وعدم تطابق غير عشوائية يسلسل تقنيات يمكن أن يعوقها هياكل الحمض النووي الريبي مستقرة. تعديل للغاية ومستقر هيكلياً طبيعة ترنس جعلها صعبة للغاية استجواب باستخدام هذه التقنيات. وحتى الآن، تقنيات الجيل القادم على أساس التسلسل قد لم تستخدم للخريطة الأول⁶تعديلات³⁴.

هنا، يمكننا وصف نهج بسيط ومباشر للكشف عن أنا⁶A الحمض الريبي النووي النقال التعديلات في المختبر. ويستخدم هذا الأسلوب الحضانة للكشف مع المؤتلف S. cerevisiae إيسوبينتينيل ترانسفيراز (Mod5)، تليها T1 رناسي الهضم، وتحليل التفريد جل 1-الأبعاد الخريطة الأول⁶بالتعديلات. هذا النهج المباشر ويتطلب خبرة متخصصة قليلاً لتحليل البيانات. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب قابلة للتكيف للحمض النووي الريبي الأخرى تعديل الإنزيمات، بما فيها الإنزيمات التي تساهمي تغيير الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي أو التنقل رنا عبر هلام.