Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

Modifiche RNA almeno 163 posttranscriptional distinte sono state identificate, con queste modifiche che conferisce funzioni diverse e dipendente dal contesto di RNAs, direttamente che influenzano la struttura di RNA e che interessano interazioni di RNA con altri molecole^1,2. L’apprezzamento per il numero e la varietà di RNA modifiche aumenta, è fondamentale per sviluppare le analisi che possono interrogare in modo affidabile sia le modifiche di RNA e gli enzimi che catalizzano loro.

Si verifica una delle prime modifiche di RNA di essere identificato a base 37 in tRNAs, adiacente al anti-codone^3,di lato per 3′⁴. Un gruppo di isopentenyl viene trasferito da dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) nella posizione di N6 di adenosina 37 (ho⁶A37) ^3,5 su un sottoinsieme di tRNAs sia citoplasmiche e mitocondriali. Ho⁶A37 migliora la fedeltà di traduzione ed efficienza aumentando affinità di tRNA per il ribosoma^4,6 e ho⁶A37 è importante per la risposta allo stress in batteri⁷. Gli enzimi che eseguire questa modifica sono definiti transferasi isopentenyl tRNA e sono altamente conservati in batteri^8,9, funghi¹⁰, vermi¹¹, piante¹²e più alti eucarioti¹³ , compreso gli esseri umani¹⁴.

Mutazioni nel gene umano di tRNA isopentenyl transferasi, TRIT1, sono associate con la malattia umana. Ad esempio, una mutazione in TRIT1 è correlata con una grave malattia mitocondriale, probabilmente causata da un difetto nella sintesi proteica mitocondriale^15,16. Inoltre, TRIT1 è stato descritto come un tumore soppressore gene^17,18 ed è implicata in parecchi tipi di cancri, compreso il melanoma¹⁹, seno²⁰, gastrico²¹e cancri polmonari^{22 ,23}. Infine, TRIT1 e Mod5 transferasi isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) sono soggette a aggregazione proteine che formano il prione-come le fibre amiloidi^24,25,26. Queste osservazioni implicano potenzialmente transferasi di isopentenyl tRNA nelle malattie neurodegenerative, anche se la prova diretta per questa non è ancora stata dimostrata.

Dato il ruolo che isopentenyl transferasi giocare nella traduzione e nella malattia, metodi che misurano direttamente i⁶un’attività della transferasi di isopentenyl sono importanti per una comprensione meccanicistica di questi enzimi normali e Stati di malattia. Un crescente numero di metodi è disponibile per individuare i modifiche di RNA A⁶, compreso in vitro isopentenylation saggi, l’ibridazione positiva in assenza di i⁶saggi un (PHA6), cromatografia su strato (TLC), aminoacido di sottile analisi di attività di accettazione e approcci di spettrometria di massa (rivisto in rif. ⁴).

Un’analisi di isopentenylation in vitro è stato descritto che utilizza ¹⁴C-DMAPP e tRNAs senza etichetta. In questo saggio, carbonio radioattivo viene trasferito al RNA dal ¹⁴C-DMAPP mediante la transferasi di isopentenyl. Mentre questo test è altamente sensibile, è spesso difficile determinare il residuo specifico che è modificato^9,20,27. Saggi PHA6 contare su una pesante modifica⁶A interferire con l’ibridazione di una ³²P-labeled sonda che abbracciano il residuo modificato. Come tale, l’ibridazione è maggiore in assenza di una i⁶una modificazione^18,28,29. PHA6 le analisi sono altamente sensibili e in grado di analizzare il RNA totale Estratto da lisati cellulari. Inoltre, la capacità di progettare le sonde specifiche per il RNA di interesse dà tutto questo metodo obiettivo sostanziale. Tuttavia, PHA6 saggi sono limitati alla caratterizzazione delle modificazioni che si verificano sui residui all’interno della regione di destinazione della sonda e pertanto sono meno propensi a identificare nuovi modifica siti. Inoltre, come assenza di associazione è indicativo di modificazione, altre modifiche o mutazioni che influenzano il legame al RNA saranno confondere l’analisi dei dati.

Un altro approccio combina cromatografia di cellulosa di benzile DEAE cellulosa (BD) con attività di accettazione dell’aminoacido come una lettura di i⁶A modifiche nel tRNA³⁰. Questo approccio di analisi direttamente la funzione di i⁶A modifiche, ma è un approccio indiretto per individuare i⁶A modificazione e manca di risoluzione per mappare le modifiche ad un residuo specifico nel RNA. Un approccio di TLC è stato utilizzato per rilevare il tRNA totale ho⁶A modifiche. In questo approccio, internamente ³²P-labeled tRNAs sono digeriti a singoli nucleotidi e analisi TLC bidimensionale viene utilizzato per identificare isopentenylation. Questo approccio è altamente sensibile nella rilevazione totale ho⁶A in un dato campione di RNA ma sulla digestione, tutte le informazioni di sequenza sono perse; così, l’investigatore non ha modo di determinare quali residui sono stati modificati³¹.

Più recentemente, sono stati sviluppati metodi liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che confronta quantitativamente le modifiche di RNA totale tra specie, tipi di cellule e condizioni sperimentali^{32,33, 34}. Una limitazione di questa metodologia è che è meno in grado di determinare l’identità e la posizione all’interno di RNA da cui i nucleosidi modificati è stato derivato³⁴. Inoltre, le competenze e le attrezzature necessarie per eseguire questi esperimenti limitare la praticità di questo approccio.

Inoltre, diverse tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono stati sviluppati per mappare RNA modifiche transcriptome livello³⁴. Immunoprecipitazione di RNA con anticorpi specifici per una particolare modifica (RIP-Seq) permettono al ricercatore di identificare tutte le sequenze che contengono una modifica specifica^35,36. Inoltre, gli approcci basati su trascrittasi inversa come sequenza di mancata corrispondenza non casuale e Chem-Seq si basano su perturbazioni della reazione di trascrizione inversa al residui modificate^37,38,39. Nonostante il vantaggio di queste tecniche per mappare tutto il RNA modifiche del trascrittoma, RIP-seq e Chem-Seq tecnologie sono limitati dalla mancanza di anticorpi affidabili o sostanze chimiche reattive disponibili per ogni modifica specifica, rispettivamente³⁴. Inoltre, gli enzimi trascrittasi inversa necessari per eseguire Chem-Seq e tecniche di sequenziamento di mancata corrispondenza non casuale possono essere ostacolate da strutture stabili di RNA. La natura altamente modificata e strutturalmente stabile di tRNAs li rendono particolarmente difficile interrogare usando queste tecniche. Ad oggi, tecnologie basate su sequenziamento di nuova generazione ancora non sono state utilizzate per mappare i⁶un modifiche³⁴.

Qui, descriviamo un approccio semplice e diretto per individuare i⁶A tRNA modifiche in vitro. Questo metodo utilizza l’incubazione di RNA con ricombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasi (Mod5), seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per mappare i⁶A modifiche. Questo approccio è diretto e richiede competenze poco specializzata per analizzare i dati. Inoltre, questo metodo è adattabile ad altri RNA modificando gli enzimi, compreso gli enzimi che modificano covalentemente il peso molecolare di RNA o di mobilità di un RNA attraverso un gel.