Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

Mindestens 163 verschiedene posttranskritionelle RNA Modifikationen wurden identifiziert, mit diesen Änderungen Übertragung vielfältige und Kontext-abhängige Funktionen RNAs direkt RNA-Struktur zu beeinflussen und Auswirkungen auf die Beziehungen der RNA Moleküle^1,2. Mit zunehmender Wertschätzung für die Anzahl und Vielfalt der RNA Änderungen ist es wichtig, Tests zu entwickeln, die zuverlässig zu verhören kann die RNA-Modifikationen und die Enzyme, die sie katalysieren.

Eine der ersten RNA Änderungen identifiziert werden erfolgt auf Basis 37 in tRNAs, angrenzend an das Anti-Codon auf 3′ Seite^3,4. Eine Isopentenyl-Gruppe von Dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) auf die N6-Position von Adenosin 37 übertragen (ich⁶A37) ^3,5 auf eine Teilmenge der zytoplasmatischen und mitochondriale tRNAs. Ich⁶A37 verbessert die Übersetzung Treue und Effizienz durch eine Erhöhung der tRNA-Affinität für das Ribosom^4,6 und ich⁶A37 ist wichtig für die Stress-Reaktion in Bakterien⁷. Die Enzyme, die diese Änderung durchführen werden tRNA Isopentenyl Transferasen bezeichnet und sind hoch konserviert in Bakterien^8,9, Pilze¹⁰Würmer¹¹, Pflanzen¹²und höheren Eukaryoten¹³ , einschließlich Menschen¹⁴.

Mutationen im menschlichen tRNA Isopentenyl Transferase Gens, TRIT1, sind menschliche Krankheiten zugeordnet. Zum Beispiel ist eine Mutation im TRIT1 mit einer schweren mitochondrialen Erkrankung, wahrscheinlich verursacht durch einen Defekt im mitochondrialen Protein Synthese^15,16korreliert. Darüber hinaus TRIT1 wurde beschrieben als ein Tumorsuppressor Gen^17,18 und ist in verschiedene Arten von Krebs einschließlich Melanom¹⁹, Brust²⁰, Magen-²¹und Lungenkrebs^{22 verwickelt ,23}. Zu guter Letzt TRIT1 und Mod5 (Saccharomyces Cerevisiae) Isopentenyl Transferasen sind Aggregation neigen Proteine, die Prion-wie Amyloid Fasern^24,25,26bilden. Diese Beobachtungen implizieren potenziell tRNA Isopentenyl Transferasen bei neurodegenerativen Erkrankungen, obwohl direkte Beweise für diese noch nicht gezeigt wurde.

Angesichts der Rolle, dass Isopentenyl Transferasen in Übersetzung und Krankheit, Methoden, mit denen direkt ich⁶Messen spielen eine Isopentenyl-Transferase-Aktivität sind wichtig für ein mechanistisches Verständnis dieser Enzyme unter normalen Bedingungen und Krankheitszustände. Eine wachsende Zahl von Methoden stehen zur Erkennung ich⁶A RNA Änderungen, einschließlich der in-vitro- Isopentenylation-Assays, positive Hybridisierung in Ermangelung von i⁶(PHA6) Tests, thin Layer Chromatography (TLC), Aminosäure Akzeptanz-Aktivität-Assays und Massenspektrometrie Ansätze (bewertet in Ref. ⁴).

Ein in-vitro- Isopentenylation-Assay ist beschrieben worden, die ¹⁴C-DMAPP und unbeschriftete tRNAs verwendet. In diesem Test wird radioaktiven Kohlenstoff an RNA von ¹⁴C-DMAPP durch Isopentenyl-Transferase übertragen. Während dieses Tests sehr empfindlich ist, ist es oft schwierig zu bestimmen, dass bestimmte Rückstände, die^9,20,27geändert. PHA6 Assays verlasse ich mich auf die sperrigen⁶A Änderung Hybridation von ³²P-markierten Sonden überspannt die modifizierte Rückstände zu stören. Als solche Hybridisierung ist größer bei fehlender ein i⁶eine Änderung^18,28,29. PHA6-Assays sind hochsensible und geeignet zur Analyse von Gesamt-RNS von zellulären Lysates extrahiert. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, Sonden spezifisch auf die RNA von Interesse zu entwerfen diese Methode wesentliche Ziel Flexibilität. PHA6-Assays sind jedoch beschränkt auf die Charakterisierung der Änderungen, die auf Rückstände in der gezielten Region der Sonde auftreten und sind daher weniger wahrscheinlich neue Modifikation Websites identifizieren. Darüber hinaus fehlen verbindliche Richtwerte der Änderung ist, werden andere Veränderungen oder Mutationen, die RNA-bindende beeinflussen Datenanalyse verwechseln.

Ein weiterer Ansatz verbindet Benzyl DEAE Zellulose (BD) Zellulose Chromatographie mit Aminosäure Akzeptanz Aktivität als ein Auslesen von i⁶A Modifikationen in tRNA³⁰. Dieser Ansatz Proben direkt die Funktion des i⁶A Änderung, sondern es ist eine indirekte Annäherung an erkennen ich⁶A Änderung und Auflösung zuordnen Änderungen an eine bestimmte Rückstände in der RNA fehlt. Ein TLC-Ansatz verwendet wurde, um insgesamt tRNA erkennen ich⁶A Modifikationen. Bei diesem Ansatz intern ³²P-Label tRNAs werden einzelne Nukleotide verdaut und zweidimensionale TLC-Analyse wird verwendet, um Isopentenylation zu identifizieren. Dieser Ansatz ist sehr empfindlich bei der Aufdeckung von total ich⁶A in einer bestimmten RNA-Probe aber auf Verdauung, alle sequenzinformation ist verloren; So hat der Prüfer keineswegs zur Bestimmung, welche Rückstände veränderter³¹gewesen sein.

Vor kurzem sind flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden entwickelt worden, die total RNA-Änderungen zwischen Arten, Zelltypen und Versuchsbedingungen^{32,33quantitativ zu vergleichen, 34}. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es weniger in der Lage zu bestimmen, dass die Identität und die Position innerhalb der RNA aus dem modifizierten Nukleosid war³⁴abgeleitet. Darüber hinaus begrenzen das Know-how und die notwendige Ausrüstung für diese Experimente führen die Praktikabilität dieses Ansatzes.

Darüber hinaus entstanden mehrere Next Generation Sequencing Technologien um RNA Modifikationen Transkriptom-weite³⁴zuzuordnen. Immunopräzipitation RNAs mit Antikörpern, die spezifisch für eine bestimmte Änderung (RIP-Seq) ermöglichen die Ermittler alle Sequenzen mit einer spezifischen Änderung^35,36zu identifizieren. Darüber hinaus setzen Reverse-Transkriptase-basierte Ansätze wie Chem-Seq und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung auf Störungen der reversen Transkription Reaktion bei der modifizierten Rückstände^37,38,39. Trotz der Vorteil dieser Techniken RNA Modifikationen Transkriptom-weiten zuordnen sind RIP-Seq und Chem-Seq-Technologien durch den Mangel an zuverlässigen Antikörper oder reaktiven Chemikalien für jede gezielte Modifizierung bzw.³⁴begrenzt. Darüber hinaus Enzyme Reverse Transkriptase verpflichtet, Chem-Seq durchführen und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung Techniken können durch stabile RNA-Strukturen behindert werden. Die stark veränderte und strukturell stabile Natur der tRNAs machen sie besonders schwierig, mit diesen Techniken zu befragen. Bisher wurden Sequenzierung-basierten Technologien der nächsten Generation nicht noch auf Karte ich⁶Modifikationen³⁴genutzt.

Hier beschreiben wir einen einfachen und direkten Ansatz, ich⁶A tRNA Änderungen in Vitrozu erkennen. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit rekombinanten S. Cerevisiae Isopentenyl-Transferase (Mod5), gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse zuordnen ich⁶A Modifikationen. Dieser Ansatz ist direkt und erfordert wenig Fachwissen zum Analysieren der Daten. Darüber hinaus ist diese Methode anpassungsfähig an andere RNA, Enzyme, einschließlich Enzyme, die das Molekulargewicht der RNA oder einer RNA Mobilität durch ein Gel kovalent ändern ändern.