In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

Было выявлено по крайней мере 163 отдельных модификаций посттранскрипционного РНК, с этими изменениями, предоставление разнообразных и контекстно зависимые функции РНК, непосредственно влияющие на структуре РНК и затрагивающих взаимодействия РНК с другими молекулы^1,2. С увеличением признательность за количество и разнообразие модификаций РНК, важно развивать анализов, которые могут надежно допросить изменения РНК и ферменты, которые катализируют их.

Одним из первых изменений РНК идентифицировать происходит на базовый 37 в tRNAs, прилегающих к борьбе с кодоном на 3′ стороне^3,4. Группа изопентенил передается от dimethylallylpyrophosphate (ДМАФФ) в положение N6 аденозина 37 (я⁶A37) ^3,5 на подмножестве цитоплазмы и митохондриальной tRNAs. я⁶A37 улучшает верности перевода и эффективности путем увеличения tRNA сродства рибосома^4,6 и я⁶A37 имеет важное значение для реакции на стресс в бактерии⁷. Ферменты, которые выполняют эту модификацию называются трансферазы изопентенил тРНК и хорошо сохранились в бактерии^8,9,¹⁰грибов, червей¹¹, растения¹²и высших эукариот¹³ , включая¹⁴людей.

Мутации в изопентенил человека tRNA трансферазы генов, TRIT1, связаны с заболеваний человека. Например мутации в TRIT1 коррелирует с тяжелой формой болезни митохондрий, скорее всего вызвана дефектом синтеза белков митохондриальных^15,16. Кроме того был описан как опухоль подавитель гена^17,18 TRIT1 и замешан в нескольких типов рака, меланомы¹⁹, груди²⁰, желудка²¹и рака легких^{22 ,23}. Наконец TRIT1 и Mod5 изопентенил трансферазы (Saccharomyces cerevisiae) являются подверженных агрегации белков, которые формируют волокон амилоида китовая птичка как^24,25,26. Эти наблюдения потенциально затрагивать трансферазы изопентенил tRNA в нейродегенеративных заболеваний, хотя прямых доказательств для этого еще не было показано.

Учитывая роль изопентенил трансферазы в перевод и болезней, методы, которые непосредственно измерить я⁶играть деятельность трансферазы изопентенил важны для механистического понимания этих ферментов в нормальных и болезни государства. Все большее количество методов для выявления я⁶РНК изменений, в том числе в пробирке isopentenylation анализов, позитивные гибридизации в отсутствие я⁶(PHA6) assays, тонкий слой хроматографии (ТСХ), аминокислоты прием анализов деятельности и масс-спектрометрии подходы (Проверено в ссылка ⁴).

Был описан в пробирке isopentenylation assay который использует ¹⁴C-ДМАФФ и непомеченного tRNAs. В этот assay радиоактивного углерода передается РНК из ¹⁴C-ДМАФФ изопентенил трансферазы. Хотя этот assay очень чувствительна, часто бывает трудно определить, что конкретные остатки, изменен^9,20,27. PHA6 assays полагаются на громоздкие я⁶A модификация, мешая гибридизация зонда ³²P-меченых охватывающих изменение остатков. Таким образом, гибридизация больше в отсутствие я⁶модификация^18,,2829. PHA6 анализов весьма чувствительны и способны анализа всего РНК, извлеченные из клеточных лизатов. Кроме того возможность разработки конкретных зонды для РНК интерес дает гибкость существенной цели этот метод. Однако PHA6 анализов, ограничиваются характеристика изменений, которые происходят на остатки в рамках целевого региона зонда и поэтому менее склонны идентифицировать новые модификации сайтов. Кроме того как отсутствие привязки является показателем изменения, другие модификации или мутации, которые влияют на РНК привязки будет смешивать анализа данных.

Другой подход сочетает бензил открытое целлюлозы (BD) целлюлозы хроматографии с аминокислоты признание деятельности как индикация я⁶A изменения в tRNA³⁰. Этот подход непосредственно assays функции i модификация⁶A, но он является косвенный подход для выявления я⁶A модификация и не хватает резолюции для сопоставления изменений в конкретные остатков в РНК. TLC подход был использован для обнаружения всего tRNA я⁶A изменения. В этом подходе внутренне ³²P-меченых tRNAs перевариваются в одном нуклеотидов и двумерных TLC анализ используется для идентификации isopentenylation. Этот подход очень чувствительна в выявлении всего я⁶A в данной выборке РНК, но после переваривания, теряется вся информация последовательности; Таким образом следователь не имеет возможности определить, какие остатки были изменение³¹.

Совсем недавно, жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) были разработаны методы которые количественно сравнить общее РНК изменения между видами, типы клеток и экспериментальных условиях^{32,33, 34}. Ограничением этой методики является в меньшей степени способны определить, что личность и положение внутри РНК, из которого модифицированных нуклеозидов был производным³⁴. Кроме того опыт и оборудование, необходимое для выполнения этих экспериментов ограничивают практичность этого подхода.

Кроме того были разработаны несколько технологий следующего поколения последовательности для сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной³⁴. Иммунопреципитация РНК с антител специфических для конкретной модификации (RIP-Seq) позволяют следователю для выявления всех последовательностей, содержащих конкретные модификации^35,36. Кроме того подходов, основанных на обратной транскриптазы, такие Chem-Seq и неслучайных несоответствие последовательности полагаются на возмущения обратной транскрипции реакции на изменение остатков^37,,3839. Несмотря на преимущество этих методов сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной RIP-seq и Chem-Seq технологии ограничены отсутствием надежных антител или реактивной химических веществ, доступных для каждой конкретной модификации, соответственно³⁴. Кроме того обратная транскриптаза ферменты, необходимые для выполнения Chem-Seq и методы неслучайной несоответствие последовательности может сдерживаться стабильных структур РНК. Сильно изменен и структурно стабильный характер tRNAs сделать их особенно трудно допросить с помощью этих методов. На сегодняшний день, технологии следующего поколения на основе последовательности не еще были использованы для сопоставления я⁶изменения³⁴.

Здесь мы опишем простой и прямой подход для выявления я⁶A tRNA изменения в пробирке. Этот метод использует инкубации РНК с рекомбинантной S. cerevisiae изопентенил трансферазы (Mod5), следуют RNase T1 пищеварение и анализ электрофорез 1-мерного гель для сопоставления я⁶A изменения. Этот подход является прямым и требует мало специалистов для анализа данных. Кроме того этот метод адаптируется для других РНК, изменяя ферментов, в том числе ферментов, которые ковалентно изменить молекулярная масса РНК или РНК мобильности через гель.