Архитектура белковых комплексов имеет важное значение для их функционирования. Сочетание различных масс-спектрометрических методов оказался мощным, чтобы изучить их сборки. Мы предоставляем протоколы для химической сшивки и родной масс-спектрометрии и показать, как эти дополнительные методы помогают уточнить архитектура мульти субъединицы белка сборок.
Белки взаимодействуют с их лигандами формы активного и динамичного сборкам, которые осуществляют различные клеточные функции. Изучение этих взаимодействий Поэтому основополагающее значение для понимания клеточных процессов. Однако многие комплексы протеина являются динамические сборки и не доступны структурными аналогами. Масс-спектрометрия способствует структурной расследование этих Ассамблей, и особенно сочетание различных масс-спектрометрических методов обеспечивает ценную информацию в их структурные договоренности.
В этой статье мы описывают приложение и сочетание двух дополнительных масс-спектрометрических методов, а именно химической сшивки в сочетании с масс-спектрометрии и родной масс-спектрометрии. Химической сшивки включает ковалентная связь аминокислот в непосредственной близости с помощью химических реагентов. После переваривания с протеаз сшитого ди пептиды идентифицируются по масс-спектрометрии и белковых взаимодействий сайты открыты. Родной масс-спектрометрии с другой стороны является анализ сборок интактных белков в газовой фазе масс-спектрометр. Он показывает stoichiometries белка, а также взаимодействия белков и лиганда. Обе методики поэтому доставить дополнительную информацию о структуре белка лиганд сборок и их сочетание, оказался мощным в предыдущих исследованиях.
Структурные исследования белка сборок стало особенно важное значение для понимания клеточных процессов. Следовательно многие методы разработаны и улучшены в структурной биологии1. Однако эти методы иногда ограничены в их применение из-за размера, гибкости или неоднородность белковых комплексов под следствием. Масс-спектрометрия может справиться с этими проблемами и, таким образом, стала мощным инструментом в структурной биологии2,3,4,5. Самое главное преимущество масс-спектрометрии, однако, является возможность однозначно идентифицировать белки даже в сложной и неоднородной смеси6. С этой целью обычно белки усваиваются с endoproteinases и полученную смесь пептидов разделенных жидкостной хроматографии и непосредственно этого eluted в масс-спектрометр. Пептид массы впоследствии определяются и прекурсоров ионы выбираются для дальнейшей фрагментации пептидов. Белки, затем обозначаются поиска пептида и соответствующий фрагмент масс против известных базы данных. Эта процедура позволяет не только идентификация пептидов/белков, но также их столб-поступательные изменения, которые вызывают массовые сдвиг пептиды прекурсоров и фрагмент ионов, перевозящих модификации7. Некоторые из многих методов в структурных масс-спектрометрии основаны на4,этот принцип8. Например обозначая методы, такие как водорода дейтерия обмен9,10, химические маркировки стратегии11,12, или Гидроксильная группа ногой печати13,14 , дать понимание поверхности доступность белков при определенных условиях.
Другой метод (химической) сшивки с участием ковалентная связь аминокислот в непосредственной близости от через их функциональных групп. Для этого химические реактивы, УФ активируемых реагентов или аминокислоты являются занятых15,16. После сшивки, белки обычно гидролизуется с протеаз и сшитого ди пептиды анализируются жидкостной хроматографии в сочетании масс-спектрометрии. Выявление сшивки продуктов в базе данных поиска, однако, требует использования специализированного программного обеспечения, которое сцепить пептид последовательности различных белков и различных регионах17,18,19. Использование химических сшивок имеет то преимущество, что он может быть использован для почти каждый комплекс протеина интереса и не требует включения УФ активируемых аминокислот, которые может быть достигнуто только в том случае, когда выражение протеина интереса в клетки хозяина. Таким образом сшивки является универсальным инструментом и успешно применяется во многих структурных исследованиях даже большой белок сборки20.
Масс-спектрометрии комплексов интактных белков (иногда называется «родной» масс-спектрометрия), с другой стороны, включает в себя анализ интакт белками и белковых комплексов без гидролиза в пептиды. Это показывает, композиция, неоднородность, стехиометрии, топология и Субблок взаимодействия белковых комплексов21,22. В сочетании с ионной подвижности родной масс-спектрометрии далее позволяет определять их конформацию23,24. Это делает его мощным инструментом для структурной расследования белковых комплексов, которые трудно оценить структурными аналогами. Однако родной масс-спектрометрии требует анализа буферов, которые поддерживают non ковалентные белковых взаимодействий во время электроспрей ионизации. Обычно это достигается с помощью водный, летучие буферов например аммония ацетат25. Кроме того инструмент изменения необходимы для предотвращения диссоциации во время передачи в газовой фазе масс-спектрометр26. Применяется в таким образом, были проанализированы многие комплексы (большой) белок. Впечатляющие примеры являются исследования нетронутыми рибосомы27, АТФ synthases28или29вирусов.
Сочетание родной масс-спектрометрии и cross-linking оказался особенно успешным в предыдущих исследованиях. К примеру, stoichiometries сопровождающий комплексов, включая неожиданные Hsp70 димер, могут быть получены из экспериментов масс-спектрометрии комплексов интактных белков, химической сшивки выявлены механизмы белков в сборки,3031. В различные исследования были изучены последствия столб-поступательные изменения на нетронутыми АТФ-синтазы комплекса. Родной масс-спектрометрии предусмотрено понимание сложных стабильность белков в наличие или отсутствие фосфорилирование или ацетилирования32,33. Сравнительные сшивки стратегии34 затем показали конформационные изменения белкового комплекса в различных условиях.
Здесь мы предоставляем протоколы для идентификации белков, масс-спектрометрия, сшивки (химические) и родной масс-спектрометрии, включая анализ данных и интерпретации (рис. 1). Сочетание взаимодополняющих результатов, полученные из этих методов, с помощью двух хорошо изученных белковых комплексов является продемонстрировали35. Наш протокол может применяться любой Ассамблее белков, которые могут быть очищены в определенные чистоты и концентрации. Подход в некоторых случаях ограничивается анализа данных сшивки данных, т.е., размер базы данных используется, которая определяет требуемый поиск пространства и времени. Кроме того ручной проверки выявленных перекрестных ссылок часто требуется и далее уменьшает выход. Родной масс-спектрометрии ограничивается главным образом образец качества, например, буферов и аддукты используется во время очищения и возможность обменять их на водной и летучих буферов. Однако белковых комплексов, очищенный для структурного анализа обычно имеют качества, необходимые для успешного анализа с нашими протоколы.
Протоколы предназначены для массы на основе спектрометрии структурного анализа многолетних Субблок белковых комплексов. Двух методов, описанных в протоколе, главным образом доставить дополнительные результаты и хорошо подходит, чтобы получить понимание структурных договоренностей в рамках белка (-лиганд) комплексов, которые трудно изучать, структурными аналогами. Родной масс-спектрометрии обеспечивает понимание stoichiometries белка, а также взаимодействия протеина путем анализа Субкомплексы и стабильного взаимодействия модулей. Сшивки, с другой стороны, дает информацию о прямых контактов. В зависимости от крест-компоновщик используется определенную гибкость могут или должны быть включены в анализ.
Предоставленные протоколы являются в целом легко выполнять и не отнимает много времени. Весь протокол может быть выполнен в течение одной недели и может быть применен к почти всех белковых комплексов, хотя, для успешного анализа требуется определенное количество комплекс белков. Подготовка образца проста и не требует специально очищенный протеин комплексов. Однако одной типичной ошибкой является загрязнение образца во время подготовки проб для определения массы на основе спектрометрии белков. Эти загрязнений в большинстве случаев включают кератины, происходящих от пыли, кожи или волос. Поэтому осторожность как носить перчатки и лаборатории пальто, фильтрационные водный буферов и с использованием высокой чистоты растворителей следует принять в ходе подготовки проб для определения массы на основе спектрометрии белков. Другие загрязняющие белков, таких как сопровождающим обычно вводятся во время очистки белков, например, при использовании сходства Теги. В этих случаях следует улучшить очищение протеина, например путем увеличения Стиральная шаги. В любом случае, белковых загрязнений в образце легко определяются в ходе поиска по базе данных, минуя фильтр таксономии (то есть, Поиск против белков от всех видов). Если только несколько пептиды наблюдаются (т.е., низкое содержание белка покрытия могут быть получены), хотя достаточно образец доступен, он может быть необходимо использовать различные протеиназ во время пищеварения. В целом трипсина дает достаточное количество пептиды; Однако в некоторых случаях, таких как мембранных белков или домены мембранных белков, уменьшается количество сайтов tryptic расщепления и другие ферменты, ориентация гидрофобные аминокислоты являются лучшим выбором.
С точки зрения инструментария особенно измененный документ необходим для родной масс-спектрометрии, которая поддерживает non ковалентные взаимодействий во время передачи в газовой фазе. Были введены несколько типов инструментов, включая инструменты Q-ToF и Орбитрэп. В то время как изменение Q-ToF масс-спектрометров коммерчески доступны для родной масс-спектрометрии с нескольких лет, последний только недавно появились и в большинстве случаев требуют специализированных модификации45. Однако применение инструментов с высоким разрешением позволило изучению связывания нескольких лигандов и46,их количественная оценка47 и является перспективным для будущих приложений.
Чтобы определить сшитого ди пептиды, жидкостной хроматографии в сочетании масс-спектрометрии, могут применяться стандартные процедуры с несколькими изменениями. Однако поиск по базе данных является ограничивающим фактором, специализированное программное обеспечение редко могут иметь дело с большими базами данных, а также сокращение базы данных, содержащие субблоков протеина комплексов требуются. Недавние исследования использовали Массовое спектрометрирование горные сшивок ориентации взаимодействий протеина в всю ячейку лизатов48,49. Использование химических сшивок, которые фрагмента в тандеме масс-спектрометрии экспериментов основном дает линейной пептиды (изменена крест-компоновщик), которые могут быть идентифицированы по дальнейшей фрагментации и базы данных поиска линейной пептидов, и это уменьшает время поиска и вычислительной поиск пространства. Однако чтобы выполнить эти эксперименты, требуется масс-анализатор для ионной ловушки или гибридный масс-спектрометр с ионной ловушки. В общем как ложных срабатываний являются важным вопросом, массовые спектры сшитого пептиды часто проверяются вручную по качеству их спектры фрагмент который простирается время анализа данных чрезвычайно. Разработка надежных скоринговых систем, которые могут быть применены без дальнейших шагов проверки являются поэтому потенциальных будущих приложений. Одним из способов для улучшения анализа данных и уменьшить количество ложных срабатываний было введение ложных обнаружения скорость расчетов и их применение для сшивки50наборов данных.
В общем, описанные здесь методы могут быть дополнены далее масс-спектрометрии методов (например, ковалентных маркировки) увеличить вывод из анализа. Другие изменения и улучшения протоколов могут быть легко реализованы. Как таковой сравнительных сшивки34 распутывает конформационные изменения в Ассамблее белка. Дальнейшие события в родной масс-спектрометрии в настоящее время позволяют анализ мембранных белков51,52 и их взаимодействия с липидами28,52,,5354 . Новые разработки с высоким разрешением масс-спектрометров для родной масс-спектрометрии расширили приложение и Связывание лиганда, например, Связывание липидов в мембранных белков, теперь могут быть включены в анализ45, 46. в сочетании с подходами, численное моделирование, эти методы могут доставить структурной модели различной резолюции55. Если не кристаллические структуры доступны для нетронутыми сложных или единого подразделения, масс-спектрометрия может доставить первое понимание взаимодействия протеина и топология неизвестного комплекса. В зависимости от используемых методов и полученных результатов с низким разрешением модели неизвестного комплекса могут быть получены56,,5758. Если доступны кристаллические структуры или модели гомологии, структурной информации, полученной от масс-спектрометрии может принести даже почти родной модели59.
По сравнению с другими структурные методы, масс-спектрометрия имеет то преимущество, что она требует низкой выборки сумм, он может справиться с разнородными образцами и применима к белковых комплексов неограниченного размера. Кроме того масс-спектрометрии позволяет исследование систем динамических белка. Различных популяциях белка или комплекс белков, которые существуют в растворе обычно анализируются вместе и поэтому, в отличие от с другими структурными методами, которые требуют выбора определенных групп населения, все конформации поддерживаются во время анализ и являются оценимый в одном эксперименте. Недавно появившаяся34,,6061 и количественных сшивки подходы являются многообещающими для будущих приложений, описывающих конформационные изменения в различных условиях.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим наших коллег за полезные дискуссии. Мы также благодарим Ilme Шлихтинг и Карл-Петер Hopfner за предоставление белковых комплексов. Мы признаем, что финансирование от федерального министерства для образования и исследования (BMBF, Зик программы, 03Z22HN22), европейские региональные фонды развития (EFRE, ZS/2016/04/78115) и MLU Галле-Виттенберг C.S. и финансирование от Уэллком траст (109854/658 Z/15/Z) чтобы а.п.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |