Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.
Proteinlerin çeşitli hücresel işlevlerini gerçekleştirecek formu etkin ve dinamik derlemeler için onların ligandlar etkileşim. Bu etkileşimler elucidating bu nedenle hücresel süreçleri anlamak için esastır. Ancak, birçok protein kompleksleri dinamik derlemeler ve konvansiyonel yapısal teknikleri tarafından erişilebilir değildir. Kütle spektrometresi bu derlemeler yapısal araştırmaya katkıda bulunur ve özellikle çeşitli kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi kendi Yapısal düzenleme değerli içgörüler sunar.
Bu makalede, biz uygulama ve iki tamamlayıcı kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi tanımlamak, yani kimyasal cross-linking kütle spektrometresi ve yerel kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Kimyasal cross-linking amino asitlerin birbirine yakın kovalent bağ kimyasal reaktifler kullanarak içerir. Sonra sindirim proteaz ile çapraz bağlı di-peptidler kütle spektrometresi tarafından tanımlanır ve protein etkileşimleri ele geçen sitelerdir. Yerel kütle spektrometresi Öte yandan bir Kütle Spektrometre gaz aşamasında olduğu gibi protein derlemeler analizidir. Protein stoichiometries yanı sıra protein ve ligand etkileşimleri ortaya koymaktadır. Her iki tekniğin de bu nedenle protein-ligand derlemeler ve onların birlikte önceki çalışmalarda güçlü olduğunu kanıtladı yapısını tamamlayıcı bilgi sunar.
Protein derlemeler yapısal incelenmesi özellikle hücresel süreçleri anlamak için önemli hale gelmiştir. Sonuç olarak, birçok teknikleri geliştirilmiş ve Yapısal Biyoloji1‘ geliştirilmiş. Ancak, bu teknikler bazen onların uygulama boyutu, esneklik veya protein kompleksleri soruşturma altında heterojen nedeniyle sınırlıdır. Kütle spektrometresi bu zorlukları ile başa çıkabilirim ve bu nedenle, Yapısal Biyoloji2,3,4,5güçlü bir araç olarak ortaya çıktı. Kütle spektrometresi, en büyük avantajı ise belirsizliğe yer bırakmadan proteinler bile karmaşık ve heterojen karışımları6‘ tanımlama yeteneği. Bu amaçla, proteinler genellikle endoproteinases ile sindirmek ve elde edilen peptid karışımı sıvı Kromatografi tarafından ayrılmış ve doğrudan Kütle Spektrometre eluted. Peptid kitleler daha sonra belirlenir ve öncü iyonlar daha fazla peptidler parçalanma için seçilir. Proteinler sonra arama peptid ve bilinen bir veritabanında karşılık gelen parçası kitleler tarafından tanımlanır. Bu yordam sadece peptidler/protein değil, aynı zamanda bir kitle değişim habercisi peptidler ve değişiklik7taşıyan parçası iyonları neden onların translasyonel modifikasyonlar kimliği verir. Bazı yapısal kütle spektrometresi birçok teknikler üzerinde bu ilke4,8temel alır. Örneğin, hidrojen döteryum Satım9,10gibi teknikleri etiketleme, kimyasal etiketleme stratejileri11,12veya radikal hidroksil ayak baskı13,14 , yüzey erişilebilirlik belirli koşullar altında proteinlerin içine anlayışlar verebilir.
(Amino asitlerin birbirine yakın onların fonksiyonel gruplar aracılığıyla kovalent bağ içeren cross-linking kimyasal) başka bir tekniktir. Bunun için istihdam15,16kimyasal reaktifler, UV alınabilen reaktifler veya amino asitler vardır. İlişkilendirerek sonra proteinler genellikle proteaz ile hidrolize ve çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi analiz edilir. Cross-linking ürünler arama, veritabanı tarafından kimlik ancak, çeşitli proteinler ve birbirinden farklı bölgeler17,18,19peptid dizileri bir arada özel yazılım kullanımı gerektirir. Kimyasal cross-linkers kullanımı ilgi hemen hemen her protein kompleksi için istihdam ve does değil istemek sadece protein konak hücreleri ilgi ifade edilirken elde edilebilir ve UV alınabilen amino asitler, birleşme avantajı vardır. Bu nedenle, cross-linking çok yönlü bir araçtır ve başarıyla birçok yapısal bile büyük protein derlemeler20çalışmalarda istihdam edildi.
Kütle spektrometresi (bazen olarak adlandırılır ‘Yerel’ kütle spektrometresi) olduğu gibi protein kompleksleri, diğer taraftan, peptidler sağlam protein ve protein kompleksleri hidroliz olmadan analizini içerir. Kompozisyon, heterojenlik, stoichiometry, topoloji ve alt birim etkileşimleri protein kompleksleri21,22ortaya koymaktadır. İyon hareketlilik ile birlikte, yerel kütle spektrometresi daha da onların uyum23,24tayini sağlar. Bu geleneksel yapı teknikleri tarafından değerlendirmek zordur protein kompleksleri yapısal incelenmesi için güçlü bir araç sağlar. Ancak, yerel kütle spektrometresi kovalent olmayan protein etkileşimleri electrospray iyonlaşma sırasında korumak analiz arabellekleri gerektirir. Bu genellikle sulu, uçucu arabellekleri amonyum asetat25gibi kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, araç değişiklikler ayrılma Kütle Spektrometre26gaz fazına iletim sırasında önlemek gereklidir. Bu şekilde uygulanan, birçok (büyük) protein kompleksleri analiz edildi. Sağlam ribozomlara27, ATP synthases28veya virüs29çalışmaları etkileyici örnekleridir.
Yerel kütle spektrometresi ve cross-linking önceki çalışmalarda özellikle başarılı oldu. Kimyasal cross-linking proteinler arasında düzenlemelerin ortaya iken Örneğin, refakatçi kompleksleri, beklenmedik bir Hsp70 dimer dahil olmak üzere stoichiometries olduğu gibi protein kompleksleri kütle spektrometresi deneylerden elde edilebilir derlemeler30,31. Farklı bir çalışmada, karmaşık bir bozulmamış ATP sentaz üzerinde translasyonel modifikasyonlar etkileri incelenmiştir. Yerel kütle spektrometresi protein kompleksi istikrar anlayışlar fosforilasyon veya asetilasyon32,33içinde sağlanan. Karşılaştırmalı cross-linking strateji34 sonra farklı koşullar altında karmaşık proteinin konformasyon değişiklikler ortaya çıkar.
Burada, protein tanımlama için kütle spektrometresi, (kimyasal) cross-linking ve veri analizi ve yorumu (şekil 1) dahil olmak üzere yerel kütle spektrometresi tarafından protokolleri sağlamak. Tamamlayıcı sonuçları iki iyi karakterize protein kompleksleri yardımıyla bu yöntemlerle elde edilen gösterdiği35birleşimidir. Bizim iletişim kuralı belirli saflık ve konsantrasyon saf herhangi bir protein bütünleştirilmiş uygulanabilir. Yaklaşım veri, Yani, veritabanının boyutunu cross-linking veri analizi tarafından sınırlı bazı durumlarda, gerekli arama uzay ve zaman belirler istihdam edilmektedir. Buna ek olarak, belirlenen çapraz bağlantıları el ile doğrulama kez gereklidir ve çıkış daha da azaltır. Yerel kütle spektrometresi çoğunlukla örnek kalite, örneğin, arabellekleri tarafından sınırlıdır ve adducts onları sulu ve uçucu arabellekleri tarafından Döviz için arıtma ve olasılığını sırasında kullanılan. Ancak, yapısal analiz için genellikle saf protein kompleksleri bizim protokol ile başarılı analiz için gerekli kalite var.
İletişim kuralları kütle spektrometresi tabanlı yapısal analizi çok alt birim protein kompleksleri için sağlanır. İletişim kuralında, açıklanan iki teknikleri, çoğunlukla tamamlayıcı sonuçlar ve protein içinde yapısal düzenlemeler anlayışlar kazanmak için uygundur (-ligand) tarafından geleneksel yapı teknikleri eğitim zor olan kompleksleri. Yerel kütle spektrometresi subcomplexes ve istikrarlı etkileşim modülleri analiz ederek protein stoichiometries yanı sıra protein etkileşimleri içine anlayışlar sunar. İlişkilendirerek, öte yandan, doğrudan ilgili siteler hakkında bilgi verir. Bağlı olarak kullanılan cross-linker, belirli bir esneklik olabilir veya analize dahil.
Genel olarak gerçekleştirmek kolay ve değil zaman alıcı sağlanan kurallarıdır. Tüm iletişim kuralı bir hafta içinde çalıştırılabilir ve belirli bir miktarda protein kompleksi başarılı analiz için gerekli olmasına rağmen hemen hemen tüm protein kompleksleri için uygulanabilir. Numune hazırlama basittir ve özellikle saf protein kompleksleri gerektirmez. Ancak, yaygın bir hatadır kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında örnek kirlenme var. Çoğu durumda bu contaminations toz, deri veya saç kaynaklanan keratins içerir. Bu nedenle, eldiven ve laboratuvar mont giyiyor gibi ilave, Sulu arabellekleri filtrating ve yüksek saflıkta çözücüler kullanılarak kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında özen gösterilmelidir. Benzeşme Etiketler kullanırken chaperones gibi bulaşıcı diğer proteinler protein arıtma sırasında örneğin, genellikle tanıtılmaktadır. Bu gibi durumlarda, protein saflaştırma, örneğin çamaşır adımları artırarak geliştirilmesi. Her durumda, örnekteki protein contaminations kolayca veritabanı arama sırasında taksonomi filtre ihmal olarak tanımlanır (Yani, tüm türlerden proteinler karşı arama). Eğer sadece birkaç peptidler gözlenir (Yani, düşük protein kapsama elde edilebilir), yeterli örnek kullanılabilir olsa bile, farklı bir İndinavir sindirim sırasında kullanmak gerekli olabilir. Genel olarak tripsin peptidler yeterli sayıda verir; Ancak, membran proteinlerinin veya proteinlerin membran etki alanları gibi bazı durumlarda tryptic bölünme sitelerin sayısı azalır ve hidrofobik amino asitler hedefleme diğer enzimler daha iyi bir seçimdir.
Araçları açısından, özellikle değiştirilmiş bir enstrüman gaz fazına aktarmadan kovalent olmayan etkileşimleri tutar yerli kütle spektrometresi gereklidir. Q-ToF ve orbitrap aletler dahil olmak üzere çeşitli araç türleri getirilmiştir. Değiştirilmiş Q-ToF Kütle Spektrometre Sistemleri beri birkaç yıl için yerel kütle spektrometresi ticari olarak mevcut olmakla birlikte, ikinci ancak son zamanlarda kullanılmaya başlanan ve çoğu durumda özel değişiklik45gerektirir. Ancak, uygulama yüksek çözünürlüklü aletleri bağlama birden çok ligandlar ve onların miktar46,47 eğitim izin ve gelecekteki uygulamalar için umut verici.
Çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi tanımlamak için birkaç değişiklik ile standart yordamlar uygulayabilirsiniz. Ancak, veritabanı arama sınırlayıcı bir faktör olarak özel yazılım nadiren büyük veritabanları ile başa çıkabilirim ve kompleksleri protein alt içeren azaltılmış veritabanları gerekli olur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kullanılan Kütle spektrometresi yarilabilir cross-linkers protein etkileşimler tüm hücre lysates48,49hedefleme. Tandem kütle spektrometresi deneylerde çoğunlukla parçası kimyasal cross-linkers kullanımı daha fazla parçalanma tarafından tanımlanan, (cross-linker tarafından değiştirilmiş) doğrusal peptidler verimleri ve doğrusal peptidler ve bu veritabanı arama azaltır arama süresi ve Hesaplamalı Arama alanı. Ancak, bu deneyler gerçekleştirmek için bir iyon kapanı kitle Analyzer’ı veya bir melez Kütle Spektrometre ile bir iyon kapanı gereklidir. Yanlış-mutlak önemli bir konu olduğundan, genel olarak, çapraz bağlı peptidler kitle spectra kez el ile veri analiz süresini son derece uzanan kalitesi onların parçası spectra ile doğrulanır. Daha fazla doğrulama adımları bu nedenle potansiyel gelecekteki uygulamalar olmadan, uygulanacak sağlam puanlama sistemlerinin geliştirilmesi. Veri Çözümleme geliştirmek ve yanlış-mutlak sayısını azaltmak için bir yol yanlış bulma oranı hesaplamalarını ve veri kümeleri50cross-linking üzere giriş oldu.
Genel olarak, burada açıklanan teknikler daha fazla kütle spektrometresi teknikleri ile tamamlanmaktadır (örneğin, kovalent etiketleme) analizi çıktısı artırmak için. Diğer değişiklikler ve geliştirmeler iletişim kurallarının kolayca uygulanabilir. Bu nedenle karşılaştırmalı cross-linking34 protein derlemesinde konformasyon değişiklikleri unravels. Daha fazla yerel kütle spektrometresi gelişmeler günümüzde membran proteinleri51,52 analizi ve onların etkileşim lipidler28,52,53,54 ile izin . Yüksek çözünürlüklü Kütle Spektrometreleri yerli kütle spektrometresi için yeni gelişmeler uygulama ve ligand taşıması, örneğin, lipitler membran proteinlerinin için bağlama genişletilmiş var, şimdi analiz45‘, dahil edilebilir 46. sayısal modelleme yaklaşımlar ile birlikte, bu tekniklerin çözünürlük55değişen Yapısal modeller sunabilirsiniz. Hiçbir Kristal yapıları olduğu gibi karmaşık veya tek alt birimleri için kullanılabilir varsa, kütle spektrometresi ilk yorumlara protein etkileşimleri ve bilinmeyen karmaşık topoloji teslim edebilirsiniz. Kullanılan teknikler ve elde edilen sonuçlar bağlı olarak, düşük çözünürlüklü modeller bilinmeyen kompleks56,57,58elde edilebilir. Kristal yapıları veya homoloji modelleri kullanılabiliyorsa, kütle spektrometresi alınan yapısal bilgi bile yakınındaki yerli modelleri59yol açabilir.
Diğer yapısal teknikleri ile karşılaştırıldığında, kütle spektrometresi avantajı vardır bu düşük örnek gerektiren, türdeş olmayan örnekleri ile başa çıkabilirim ve Sınırsız büyüklükte protein kompleksleri için geçerlidir. Ayrıca, kütle spektrometresi dinamik protein sistemleri araştırma sağlar. Çözüm içinde protein veya protein kompleksi farklı nüfus genellikle birlikte analiz edilir ve bu nedenle, farklı olarak belirli nüfusun seçimi gerektiren diğer yapısal teknikleri ile tüm biçimler sırasında korunur analiz ve olan bir deneyde değerlendirilebilir. Kantitatif yaklaşımlar cross-linking son zamanlarda tanıtılan34,60,61 ve gelecekteki uygulamalar farklı koşullar altında konformasyon değişiklikleri açıklayan için umut verici.
The authors have nothing to disclose.
Biz bizim meslektaşları yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Biz de Ilme Schlichting ve Karl-Peter Hopfner protein kompleksleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Federal Bakanlıktan eğitim ve araştırma için fon kabul (BMBF, ZIK programı, 03Z22HN22), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (EFRE, ZS/2016/04/78115) ve MLU Halle-Wittenberg C.S. ve Wellcome Trust (109854/658 finansman Z/15/Z) A.P. için
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |