La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.
Proteínas interactúan con sus ligandos a asambleas activa y dinámica de forma que llevar a cabo diversas funciones celulares. Aclaración de estas interacciones es fundamental para la comprensión de los procesos celulares. Sin embargo, muchos complejos de la proteína están ensamblados dinámicos y no son accesibles mediante técnicas estructurales convencionales. Espectrometría de masas contribuye a la investigación estructural de estas asambleas, y particularmente la combinación de varias técnicas de espectrometría de masa proporciona penetraciones valiosas en su arreglo estructural.
En este artículo, describimos la aplicación y combinación de dos técnicas complementarias de espectrometría de masa, es decir, reticulación química junto con la espectrometría de masas y espectrometría de masas nativa. Reticulación química involucra el acoplamiento covalente de aminoácidos cerca mediante el uso de reactivos químicos. Después de la digestión con proteasas, reticulados di-péptidos están identificados por espectrometría de masas y sitios de interacción de la proteína están al descubierto. Espectrometría de masas nativa por otra parte es el análisis de conjuntos de proteínas intactas en la fase gaseosa de un espectrómetro de masas. Revela stoichiometries de proteína así como las interacciones de la proteína y de ligando. Ambas técnicas por lo tanto ofrecen información complementaria sobre la estructura de las Asambleas de proteína-ligando y su combinación probada en estudios previos de gran alcance.
La investigación estructural de los conjuntos de proteínas se ha vuelto particularmente importante para la comprensión de los procesos celulares. En consecuencia, muchas técnicas se han desarrollado y mejorado en biología estructural1. Sin embargo, estas técnicas son a veces limitadas en su aplicación debido al tamaño, la flexibilidad o la heterogeneidad de los complejos de proteína bajo investigación. Espectrometría de masas puede hacer frente a estos desafíos y, por lo tanto, surgió como una poderosa herramienta en biología estructural2,3,4,5. La mayor ventaja de espectrometría de masas, sin embargo, es la capacidad de identificar inequívocamente proteínas en mezclas complejas y heterogéneas6. Para ello, proteínas generalmente son digeridas con endoproteinases y la mezcla resultante del péptido se separa por cromatografía líquida y eluyen directamente en el espectrómetro de masas. Posteriormente se determinan las masas de los péptidos y los iones precursores seleccionados de mayor fragmentación de los péptidos. Las proteínas entonces se identifican por péptido busca y masas de fragmento correspondiente contra una base de datos conocido. Este procedimiento no sólo permite la identificación de péptidos/proteínas sino también sus modificaciones post-traduccionales que causan un cambio de masa de los péptidos precursores y los iones fragmento que la modificación7. Algunas de las muchas técnicas de espectrometría de masas estructural se basan en este principio4,8. Por ejemplo, etiquetado técnicas como hidrógeno deuterio intercambio9,10, de11,de estrategias de etiquetado químico12o radical hidroxilo pie de impresión13,14 , dar información sobre la accesibilidad de la superficie de las proteínas bajo ciertas condiciones.
Otra técnica es (química) Cross-linking que involucra el acoplamiento covalente de aminoácidos en proximidad cercana a través de sus grupos funcionales. Para ello, reactivos químicos, reactivos UV-activatable o aminoácidos son empleados15,16. Después de cross-linking, las proteínas generalmente son hidrolizadas con proteasas y reticulados di-péptidos, son analizados por espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos. La identificación de los productos Cross-linking de base de datos de búsqueda, sin embargo, requiere el uso de software especializado que concatenar secuencias de péptidos de diferentes proteínas y dispares regiones17,18,19. El uso de cross-linkers química tiene la ventaja de que puede ser empleado para casi cada complejo de la proteína de interés y no requiere la incorporación de aminoácidos UV-activatable, que sólo se logra expresar la proteína de interés en las células del huésped. Como tal, Cross-linking es una herramienta versátil y fue empleado con éxito en muchos estudios estructurales de proteínas grandes asambleas20.
Espectrometría de masas de complejos de proteína intacta (a veces llamado ‘nativo’ espectrometría de masas), por el contrario, implica el análisis de proteínas intactas y complejos de la proteína sin hidrólisis en péptidos. Revela composición, heterogeneidad, estequiometría, topología y las interacciones de la subunidad de la proteína complejos21,22. En combinación con la movilidad de iones, espectrometría de masas nativa más permite la determinación de su conformación23,24. Esto es una poderosa herramienta para la investigación estructural de complejos de proteína que son difíciles de evaluar mediante técnicas estructurales convencionales. Sin embargo, espectrometría de masas nativa requiere buffers de análisis que las interacciones no covalentes de proteínas durante la ionización por electrospray. Esto se logra mediante el uso de buffers acuosos, volátiles como amonio acetato25. Además, instrumento modificaciones son necesarias para evitar la disociación durante la transmisión en la fase gas del espectrómetro de masas26. Aplicado de esta manera, se analizaron muchos complejos de la proteína (grande). Ejemplos impresionantes son los estudios de ribosomas intactos27, ATP sintasas28o29de virus.
La combinación de espectrometría de masas nativa y cross-linking resultó particularmente exitosa en estudios anteriores. Por ejemplo, los stoichiometries de complejos de acompañante, incluyendo un inesperado dimer de Hsp70, podrían obtenerse experimentos de espectrometría de masas de los complejos de proteína intacta, mientras que el cross-linking químico reveló los arreglos de las proteínas en el Asambleas de30,31. En un estudio, se estudiaron los efectos de modificaciones poste-de translación en un intacto synthase del ATP complejo. Espectrometría de masas nativa proporciona penetraciones en la estabilidad complejos de proteína en la presencia o ausencia de fosforilación o acetilación de32,33. Una estrategia Cross-linking comparativo34 reveló cambios conformacionales de la proteína del complejo bajo las diferentes condiciones.
Presentamos los protocolos para la identificación de proteínas por espectrometría de masas, Cross-linking (química) y espectrometría de masas nativa, incluyendo análisis de datos e interpretación (figura 1). La combinación de resultados complementarios de estos métodos con la ayuda de dos complejos de la proteína bien caracterizado es demostrada35. Nuestro protocolo se puede aplicar a cualquier conjunto de proteínas que puede ser purificado en cierta pureza y concentración. El enfoque es en algunos casos limitadas por el análisis de los datos de la reticulación de los datos, es decir, el tamaño de la base de datos empleado, que determina la búsqueda requiere espacio y tiempo. Además, validación manual de enlaces cruzados identificados a menudo es necesario y reduce aún más la salida. Espectrometría de masas nativa está limitada sobre todo por la calidad de la muestra, por ejemplo, tampones y aductores utilizado durante la purificación y la posibilidad de canjearlos por buffers acuosos y volátiles. Sin embargo, complejos de la proteína purificados para análisis estructural generalmente tienen la calidad necesaria para el análisis de éxito con nuestros protocolos.
Protocolos se proporcionan para análisis estructural basada en espectrometría de masa de complejos multi-subunidades de la proteína. Las dos técnicas, descritas en el protocolo, en su mayoría ofrecen resultados complementarios y son adecuadas para ganar penetraciones en los arreglos estructurales en proteínas (-ligando) complejos que son difíciles de estudiar por técnicas estructurales convencionales. Espectrometría de masas nativa proporciona penetraciones en los stoichiometries de proteína así como las interacciones entre proteínas analizando Subcomplejos de mando y módulos de interacción estable. Cross-linking, por otro lado, aporta información sobre sitios de contacto directos. Dependiendo de la vinculante utilizado, cierta flexibilidad puede o debe incluirse en el análisis.
Los protocolos proporcionados son en general fácil de realizar y no requiere mucho tiempo. El conjunto del Protocolo puede ser ejecutado dentro de una semana y se puede aplicar a casi todos los complejos de la proteína, aunque una cierta cantidad de la proteína compleja se requiere para el análisis de éxito. Preparación de la muestra es sencilla y no requiere específicamente complejos de la proteína purificada. Sin embargo, una trampa común es la contaminación de la muestra durante la preparación de muestras para identificación de proteínas basada en espectrometría de masa. Estas contaminaciones en la mayoría de los casos incluyen queratinas que originan polvo, piel o cabello. Por lo tanto, adicional como uso de guantes y batas de laboratorio, filtración acuosas almacenadores intermediarios y el uso de solventes de alta pureza deben tenerse cuidado durante la preparación de muestras para identificación de proteínas basada en espectrometría de masa. Otras proteínas contaminantes como acompañantes generalmente se introducen durante la purificación de la proteína, por ejemplo, cuando se utiliza etiquetas de afinidad. En estos casos, purificación de proteínas debe mejorarse, por ejemplo mediante el aumento de pasos de lavado. En cualquier caso, la contaminación de la proteína en la muestra se pueden identificar fácilmente durante la búsqueda de la base de datos omitiendo el filtro de la taxonomía (es decir, buscar contra las proteínas de todas las especies). Si sólo se observan unos péptidos (es decir, una cobertura baja en proteínas podría obtenerse), aunque muestra suficiente está disponible, puede ser necesario utilizar una proteinasa diferentes durante la digestión. En general la tripsina produce un número suficiente de péptidos; sin embargo, en algunos casos como proteínas de membrana o membrana dominios de proteínas, se reduce el número de sitios de división tríptica y otras enzimas dirigidas a hidrofóbicos aminoácidos son una mejor opción.
En términos de instrumentación, un instrumento especialmente modificado se requiere para espectrometría de masas nativa que mantiene interacciones no-covalentes durante la transferencia en la fase de gas. Se han introducido varios tipos de instrumentos, incluyendo instrumentos de Q-ToF y orbitrap. Mientras que modificado Q-ToF espectrómetros de masas están comercialmente disponibles para espectrometría de masas nativa desde hace varios años, estos últimos fueron introducidos recientemente y en la mayoría de los casos requieren modificación especializada45. Sin embargo, la aplicación de instrumentos de alta resolución permite estudiar la Unión de ligandos múltiples y su cuantificación46,47 y es prometedor para futuras aplicaciones.
Para identificar reticulados di-péptidos mediante espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos, se pueden aplicar procedimientos estándar con pocas modificaciones. Sin embargo, la búsqueda de la base de datos es el factor limitante como software especializado puede tratar raramente con grandes bases de datos y reducidos las bases de datos que contienen las subunidades de proteínas de los complejos son necesarios. Estudios recientes utilizan masa espectrometría escindibles cross-linkers dirigida a las interacciones de proteínas en célula entera lisados48,49. El uso de químicos cross-linkers que fragmento sobre todo en experimentos de espectrometría de masas tándem produce péptidos lineales (modificados por la vinculante), que pueden ser identificados por mayor fragmentación y búsqueda de la base de datos de péptidos lineales y esto reduce buscar el tiempo y el espacio de búsqueda computacional. Sin embargo, para realizar estos experimentos, un analizador de masas de trampa iónica o un espectrómetro de masas híbrido con una trampa de iones es necesario. En general, como falsos positivos son un tema importante, espectrometría de masas de péptidos reticulados es a menudo validado manualmente por la calidad de sus espectros de fragmento que amplía enormemente el tiempo de análisis de datos. Desarrollo de robustos sistemas de puntuación que se pueden aplicar sin más pasos de validación, por tanto, son posibles aplicaciones futuras. Una forma para mejorar el análisis de datos y reducir el número de falsos positivos fue la introducción de cálculos de tarifa falsa del descubrimiento y su aplicación a Cross-linking de conjuntos de datos50.
En general, las técnicas aquí descritas pueden complementarse con otras técnicas de espectrometría de masas (p. ej., etiquetado covalentes) para aumentar la salida del análisis. Otras modificaciones y mejoras de los protocolos pueden ser implementados fácilmente. Como tal comparativa Cross-linking34 revela cambios conformacionales en la Asamblea de la proteína. Más avances en espectrometría de masas nativa hoy en día permiten el análisis de membrana proteínas51,52 y sus interacciones con los lípidos28,52,53,54 . Novedades de espectrómetros de masas de alta resolución para espectrometría de masas nativa han extendido la aplicación y atascamiento del ligand, por ejemplo, Unión de lípidos a proteínas de la membrana, ahora pueden ser incluidos en el análisis45, 46. en combinación con métodos de Modelado computacional, estas técnicas pueden ofrecer modelos estructurales de diferentes resolución55. Si no las estructuras cristalinas están disponibles para las subunidades complejas o solo intactas, espectrometría de masas puede entregar primera penetraciones en las interacciones de la proteína y la topología del complejo desconocido. Dependiendo de las técnicas utilizadas y los resultados obtenidos, se pueden obtener modelos de baja resolución del complejo desconocido56,57,58. Si se dispone de las estructuras cristalinas o modelos de la homología, la información estructural espectrometría de masas puede producir incluso materno modelos59.
En comparación con otras técnicas estructurales, espectrometría de masas tiene la ventaja de que requiere cantidades de muestra baja, se puede tratar con muestras heterogéneas y es aplicable a los complejos de la proteína de tamaño ilimitado. Además, la espectrometría de masas permite la investigación de sistemas de dinámica de proteínas. Las diferentes poblaciones de la proteína o complejo de proteínas que existen en solución generalmente se analizan juntos y por lo tanto, a diferencia con otras técnicas estructurales que requieren la selección de determinadas poblaciones, conformaciones todos se mantienen durante Análisis y son evaluable en un experimento. Enfoques cuantitativos de cross-linking fueron recientemente introducido34,60,61 y son prometedores para futuras aplicaciones, describiendo los cambios conformacionales en condiciones diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a nuestros colegas para discusiones útiles. También agradecemos a Ilme Schlichting y Peter Karl Hopfner para dar complejos de la proteína. Reconocemos que la financiación del Ministerio Federal de educación e investigación (BMBF, ZIK programa, 03Z22HN22), los europeos fondos de Desarrollo Regional (EFRE, ZS/2016/04/78115) y el MLU Halle-Wittenberg a C.S. y financiado por el Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) a A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |