단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.
단백질은 다양 한 세포 기능을 수행 하는 형태로 활성 및 동적 어셈블리에 그들의 ligands와 상호 작용. 이러한 상호 작용을 elucidating 따라서 세포질 과정의 이해에 대 한 근본 이다. 그러나, 많은 단백질 복합물 동적 어셈블리 이며 기존의 구조적 기법에 의해 액세스할 수 있습니다. 이러한 어셈블리의 구조 조사에 기여 하는 질량 분석 그리고 특히 다양 한 대량 spectrometric 기술의 조합 그들의 구조 배열에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 합니다.
이 문서에서는, 우리는 응용 프로그램 및 두 개의 상호 보완적인 대량 spectrometric 기술의 조합 설명, 즉 화학 cross-linking 및 결합 된 질량 분석 기본 질량 분석. 화학 cross-linking 화학 시 약을 사용 하 여 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 한다. 프로 테아 제, 소화 후 복사해올된 디 펩 티 드 질량 분석에 의해 식별 하 고 단백질 상호 작용 사이트 적용 되지 않습니다. 네이티브 질량 분석은 다른 한편으로 질량 분석기의 가스 단계에서 그대로 단백질 어셈블리의 분석 이다. 그것은 단백질과 리간드 상호 작용으로 단백질 stoichiometries를 보여준다. 두 기술을 따라서 단백질-리간드 어셈블리 및 그들의 조합 이전 연구에서 강력한 입증의 구조에 대 한 보완 정보를 제공 합니다.
단백질 어셈블리의 구조 조사 세포질 과정의 이해에 대 한 특히 중요 되고있다. 따라서, 많은 기술을 개발 하 고 되었습니다 구조 생물학1에 향상. 그러나, 이러한 기술은 때로는 크기, 유연성, 또는 조사를 받고 단백질 복합물의이 그들의 응용 프로그램에 제한 됩니다. 질량 분석 이러한 문제를 해결할 수 있습니다 그리고, 따라서, 구조 생물학2,3,,45에 강력한 도구로 등장. 그러나 질량 분석의 가장 큰 장점은, 복잡 하 고 이질적인 혼합물6에 단백질을 명확 하 게 식별 하는 기능입니다. 이 위해 단백질은 일반적으로 endoproteinases로 소화 하 고 결과 펩 티 드 혼합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리 및 질량 분 서 계에 직접 eluted. 펩 티 드 질량 결정 이후에 고 선구자 이온은 펩 티 드의 추가 조각화에 대 한 선택 됩니다. 단백질 다음 검색 펩 티 드 및 알려진된 데이터베이스에 대해 해당 조각 대 중에 의해 식별 됩니다. 이 절차는 뿐만 아니라 전조 펩 티 드 및 수정7운반 조각 이온의 질량 변화를 일으킬 그들의 포스트 번역 상 수정 단백질/펩 티 드의 id를 허용 한다. 구조 질량 분석에 많은 기술 중 일부는이 원리4,8을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수소 중수소 교환9,10등 기법 라벨, 화학 라벨 전략11,12또는 수 산 기 과격 한 발 인쇄13,14 , 특정 조건 하에서 단백질의 표면 접근에 통찰력을 제공.
또 다른 기술은 이다 (화학) 그들의 기능 그룹을 통해 가까운 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 하는 교차 연결. 이 위해, 화학 시 약, UV 활성화 시 약, 또는 아미노산 고용된15,16이다. Cross-linking, 후 단백질은 프로 테아 제와 분해 일반적으로 하 고 상호 연결 된 디 펩 티 드 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 분석 된다. 그러나 데이터베이스 검색, 상호 상품의 식별은, 전문된 소프트웨어는 다양 한 단백질과 이질적인 지역17,,1819의 펩 티 드 시퀀스를 연결 하 여 사용을 해야 합니다. 화학 cross-linkers 사용 하 여 장점이 그것의 거의 모든 단백질 복합물을 채택 될 수 있다 하 고 호스트 세포의 단백질을 표현 하는 때에 달성 될 수 있는 UV 가능한 아미노산의 결합을 필요로 하지 않습니다. 이와 같이, cross-linking는 다양 한 도구 및 대형 단백질 어셈블리20의 많은 구조 연구에 성공적으로 고용 되었다.
그대로 단백질 복합물 (‘기본’ 질량 분석), 다른 한편으로의 질량 분석 펩 티 드에 그대로 단백질이 수 분해 없이 단백질 복합물의 분석을 포함 한다. 그것은 구성,이 질, 산출할, 토폴로지 및 소 단위 단백질 단지21,22의 상호 작용을 보여준다. 함께 이온 이동성, 네이티브 질량 분석 추가 그들의 구조23,24의 결정을 허용 한다. 이것은 기존의 구조적 기법으로 평가 하기 어려운 단백질 복합물의 구조상 조사를 위한 강력한 도구. 그러나, 네이티브 질량 분석 분석 버퍼를 분무 이온화 동안 비 공유 단백질 상호 작용을 유지 하는 필요 합니다. 이것은 일반적으로 암모늄 아세테이트25같은 수성, 휘발성 버퍼를 사용 하 여 달성 된다. 또한, 악기 수정 질량 분 서 계26의 가스 단계에 전송 하는 동안 분리를 방지 하기 위해 필요 하다. 이 방법으로 적용, 많은 (큰) 단백질 복합물 분석 되었다. 인상적인 그대로 리보솜27, ATP synthases28또는 바이러스29의 연구는 있습니다.
네이티브 질량 분석 그리고 cross-linking의 조합 이전 연구에서 특히 성공적 이었다. 예를 들어, 예기치 않은 Hsp70 이합체를 포함 한 보호자 단지의 stoichiometries 얻을 수 그대로 단백질 복합물의 질량 분석 실험에서 화학 cross-linking 공개에 단백질의 준비 하는 동안은 어셈블리30,31 다른 연구에서의 복잡 한 그대로 ATP synthase에 포스트 번역 상 수정 결과 공부 했다. 네이티브 질량 분석 인 산화 또는 acetylation32,33의 유무에서 단백질 복잡 한 안정성에 대 한 통찰력을 제공합니다. 비교 상호 전략34 는 다음 다른 조건 하에서 복잡 한 단백질의 구조적 변화를 밝혔다.
여기, 우리가 질량 분석, (화학) cross-linking 및 네이티브 질량 분석, 데이터 분석 및 해석 (그림 1)를 포함 하 여 단백질 식별 프로토콜 제공 합니다. 두 잘 특징이 단백질 복합물의 도움으로이 방법에서 얻은 보완 결과의 조합은 시연된35입니다. 우리의 프로토콜 특정 순도 농도에 순화 될 수 있는 어떤 단백질 어셈블리에 적용할 수 있습니다. 접근은 데이터 분석의 cross-linking 데이터, 즉, 데이터베이스의 크기에 의해 제한 하는 어떤 경우에 고용, 필요한 검색 공간 및 시간을 결정 하. 또한, 확인된 상호 링크의 수동 유효성 검사 자주 필수 이며 출력 줄어듭니다. 네이티브 질량 분석 샘플 품질, 예를 들어, 버퍼에 의해 주로 제한 됩니다 및 adducts 수성 및 휘발성 버퍼에 의해 교환 하 정화 가능성 중에 사용 된. 그러나, 일반적으로 구조 분석을 위해 순화 하는 단백질 복합물은 우리의 프로토콜 성공적인 분석에 필요한 품질을가지고.
프로토콜은 다 소 단위 단백질 복합물의 질량 분석 기반 구조 분석을 위해 제공 됩니다. 프로토콜에 설명 된 두 가지 기술을 대부분 보완 결과 제공 하 고 단백질에서 구조적 배열에 대 한 통찰력을 얻을 수 있다 (-ligand) 단지 기존의 구조 기술을 하 여 공부 하기 어려운. 네이티브 질량 분석 subcomplexes 및 안정적인 상호 작용 모듈을 분석 하 여 상호 작용 단백질으로 서 단백질 stoichiometries에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 교차 연결, 다른 한편으로, 직접 접촉 사이트에 대 한 정보를 얻을 수 있습니다. 사용 cross-linker 따라 특정 유연성 수 또는 분석에 포함 되어야 합니다.
제공 된 프로토콜 수행 하기 쉽고 하지 시간이 일반에 있습니다. 전체 프로토콜 일주일 내에서 실행 될 수 있습니다 하 고 있지만, 복잡 한 단백질의 일정 금액은 성공적인 분석에 필요한 거의 모든 단백질 복합물에 적용할 수 있습니다. 샘플 준비 간단 하 고 구체적으로 순화 된 단백질 복합물을 필요 하지 않습니다. 그러나, 하나의 범하기 오염 샘플의 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중입니다. 대부분의 경우에서 이러한 오염 먼지, 피부, 또는 머리에서 기인 하는 keratins를 포함 합니다. 따라서, 장갑 및 실험실 외 투를 입고 같은 여분 배려, 수성 버퍼도 고 순도 용 매를 사용 하 여 취해야 한다 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중. 선호도 태그를 사용 하는 경우 보호자 등 다른 오염 단백질은 일반적으로 단백질 정화, 예를 들면, 동안 소개 합니다. 이러한 경우에 단백질 정화 개선 되어야 합니다, 예를 들어 세척 단계를 증가 시켜. 어떤 경우에, 단백질 오염 샘플에는 쉽게 식별 데이터베이스 검색 동안 분류 필터를 생략 하 여 (즉, 모든 종에서 단백질에 대 한 검색). 경우에 몇 가지 펩 티 드 관찰 된다 (즉, 낮은 단백질 범위 얻어질 수), 비록 충분 한 샘플을 사용할 수 있는 그것은 다른 성분을 사용 하 여 소화 하는 동안 해야 할 수도 있습니다. 트립 신 펩 티 드;의 충분 한 번호를 생성 하는 일반적 그러나, 경우에 따라 막 단백질 또는 단백질의 막 도메인 등 tryptic 분열 사이트의 수는 감소 하 고 소수 성 아미노산을 대상으로 하는 다른 효소는 더 나은 선택 키를 누릅니다.
계측, 측면에서 특히 수정 된 악기는 가스 상으로 전송 하는 동안 공유 비 상호 작용을 유지 하는 기본 질량 분석에 대 한 필요 합니다. 여러 악기 종류, Q ToF orbitrap 악기를 포함 하 여 도입 되었습니다. 수정된 Q ToF 질량 분석기를 상업적으로 사용할 수 있는 기본 질량 분석에 대 한 몇 년 이후 후자 최근에 소개한 고 대부분의 경우에서 특수 수정45필요. 그러나, 고해상도 악기의 응용 프로그램 공부 하는 여러 개의 ligands 및 그들의 부 량46,47 바인딩을 허용 하 고 미래의 어플리케이션을 위해 유망.
액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 상호 연결 된 디 펩 티 드를 식별 하기 위해 몇 가지 수정 된 표준 절차를 적용할 수 있습니다. 그러나, 데이터베이스 검색 제한 하는 요인이 전문된 소프트웨어는 거의 큰 데이터베이스를 다룰 수 있는 그리고 감소 된 데이터베이스는 복합물의 단백질 소 단위를 포함 하는 필요 이다. 최근 연구 질량 분석 쪼갤 cross-linkers 사용 전체 세포 lysates48,49상호 작용 단백질을 대상으로. 탠덤 질량 분석 실험에서 주로 조각 화학 cross-linkers 사용 하 여 선형 펩 티 드 (는 cross-linker에 의해 수정), 추가 조각화로 식별 될 수 및 데이터베이스 검색 선형 펩 티 드, 그리고이 감소 검색 시간과 전산 검색 공간입니다. 그러나, 이러한 실험을 수행 하는 이온 트랩 질량 분석기 또는 이온 함정으로 하이브리드 질량 분석기가 필요 합니다. 일반적으로, 거짓인 중요 한 문제는, 교차 결합 된 펩 티 드의 질량 스펙트럼 종종 유효성이 검사 됩니다 수동으로 데이터 분석 시간을 엄청나게 확장 그들의 조각 스펙트럼의 품질에 의해. 추가 유효성 검사 단계는 그러므로 잠재적인 미래의 응용 프로그램 없이 적용 될 수 있는 강력한 득점 시스템을 개발. 데이터 분석을 개선 하 고 가양성의 수를 줄이는 한 가지 방법은 틀린 발견 비율 계산 및 그들의 응용 프로그램 데이터 세트50cross-linking를 소개 했다.
일반적으로, 여기서 설명 질량 분석 기술을 더 보충 될 수 있다 (예를 들어, 공유 라벨) 분석에서 출력을 높일. 다른 수정 및 프로토콜의 개선 쉽게 구현할 수 있습니다. 같은 비교 가교34 단백질 조립에 구조적 변화를 unravels. 네이티브 질량 분석에서 더 개발 요즘 막 단백질51,52 의 분석 및 지질28,,5253,54 와 그들의 상호 작용 허용 . 기본 질량 분석에 대 한 고해상도 질량 분석기의 새로운 개발 응용 프로그램 및 ligand 바인딩 예, 지질 막 단백질의 바인딩 확장, 지금 분석45, 에 포함 될 수 있습니다. 46. 전산 모델링 접근법과 함께, 이러한 기술을 다양 한 해상도55의 구조 모델을 제공할 수 있습니다. 없는 크리스탈 구조 그대로 복잡 한 또는 단일 하위 단위에 사용할 수 있는 경우에, 질량 분석 단백질 상호 작용 및 알 수 없는 복잡 한 토폴로지에 첫 번째 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사용 하는 기법에 따라 얻은 결과, 알 수 없는 복잡 한 저해상도 모델56,,5758얻어질 수 있다. 크리스탈 구조 또는 상 동 모델을 사용할 수 경우 질량 분석에서 받은 구조 정보도 근처 기본 모델59를 얻을 수 있습니다.
다른 구조 기법을 비교 하 여 질량 분석 장점이 낮은 샘플 금액 필요, 그것은 이기종 샘플을 취급할 수 있다 하 고 무제한 크기의 단백질 복합물에 적용 됩니다. 또한, 질량 분석 동적인 단백질 시스템의 조사 수 있습니다. 솔루션에 존재 하는 단백질 또는 단백질 복합물의 다른 인구 일반적으로 함께 분석 하 고 따라서 달리 특정 집단의 선택이 필요한 다른 구조 기술로 모든 conformations 유지 됩니다 동안 분석 하 고 한 실험에서 평가할 수 있는 있습니다. 정량적 상호 접근 최근에 소개 된34,,6061 고 다른 조건 하에서 구조적 변화를 설명 하는 미래의 응용 프로그램에 대 한 약속.
The authors have nothing to disclose.
우리는 유용한 논의 위해 우리의 동료를 감사합니다. 우리 또한 단백질 복합물을 제공 하기 위한 Ilme Schlichting 그리고 칼 피터 Hopfner을 감사 합니다. 우리는 교육 및 연구를 위한 연방 내각에서 자금을 인정 (BMBF, ZIK 프로그램, 03Z22HN22), 유럽 지역 개발 기금 (EFRE, ZS/2016/04/78115)와 MLU C.S. 및 Wellcome 트러스트 (109854/658에서에서 자금 할레 비 텐 베르크 Z/15/Z) 하 되
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |