タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々 な質量分析技術を組み合わせることをそのアセンブリを勉強する強力な証明しました。化学架橋とネイティブの質量分析のためのプロトコルを提供し、これらの相補的な技術が複数のサブユニット蛋白質アセンブリのアーキテクチャを明らかにする方法を示します。
タンパク質は、様々 な細胞機能を遂行するフォームのアクティブ ・動的アセンブリへの配位子と対話します。したがって、これらの相互作用の解明です細胞プロセスの理解のための基礎。しかし、多くの蛋白質の複合体は動的アセンブリ、従来構造手法からはアクセスできません。質量分析法はこれらのアセンブリの構造研究に貢献し、特に様々 な質量分析技術の組み合わせの構造配置に貴重な洞察力を提供します。
この記事で述べるアプリケーション、2 つの相補的な質量分析技術の組み合わせ、すなわち質量とネイティブの質量と相まって化学架橋します。化学架橋、化学試薬を用いた近接中のアミノ酸の結合リンクが含まれます。プロテアーゼで消化後、架橋・ ディ ・ ペプチドは、質量分析法による識別され、タンパク質の相互作用部位が発見されます。ネイティブの質量分析法は、質量分析計における気相そのまま蛋白質アセンブリの分析を一方です。タンパク質とリガンドの相互作用と同様、蛋白質の結果を明らかにします。両方の方法は、したがってタンパク質-リガンド アセンブリおよびそれらの組み合わせは以前の研究の強力な証明の構造に関する補足情報を提供します。
タンパク質複合体の構造研究は、特に重要な細胞プロセスの理解のためになりました。その結果、多くの場合、技術を開発し、構造生物学1で改善が。ただし、これらのテクニックは時々 調査中蛋白質の複合体の不均一性や柔軟性、サイズにより、アプリケーションで制限されます。質量分析法は、これらの課題に対処することができますそして、したがって、構造生物学2,3,4、5の強力なツールとして浮上しています。質量分析法の最大の利点は、複雑で、異種混合6でもタンパク質を明確に識別する能力。このため、蛋白質は通常 endoproteinases と消化され、得られたペプチド混合物を液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析計に直接溶離されます。ペプチッド固まりが決定されその後、ペプチドのフラグメント化の前駆イオンを選択しました。タンパク質は検索ペプチドおよび知られているデータベースに対して対応するフラグメント大衆によって、識別されます。この手順には、ペプチドやタンパク質も前駆体ペプチドと変更7を運ぶフラグメント イオンの質量変化をもたらします彼らのポスト翻訳の修正の識別だけでなくことができます。構造質量分析法における多くの技術のいくつかは、この原則4,8に基づいています。例えば、ラベリングなど水素重水素交換9,10技術、化学ラベリング戦略11,12、またはヒドロキシルラジカル足印刷13,14、特定の条件の下で蛋白質の表面のアクセシビリティに洞察力を与えます。
別の手法は、機能グループを通じて近くのアミノ酸の結合のリンケージを含む架橋 (化学) です。このためアミノ酸や紫外線アクティブ化可能な試薬、化学試薬が採用15,16です。、相互リンク後タンパク質はプロテアーゼと通常加水分解し、架橋・ ディ ・ ペプチドが液体クロマトグラフィー質量分析法によって分析されます。データベース検索、架橋物の同定ただし、様々 なタンパク質と別々 の地域17,18,19のペプチド配列を連結する特殊なソフトウェアの使用が必要です。化学ゲルビーズの使用には、関心のほとんどすべてのタンパク質の複合体を採用することができ、宿主細胞に興味の蛋白質を表現するときにのみ達成することができます紫外線アクティブ化可能なアミノ酸の取り込みを必要としない利点があります。など、汎用性の高いツールです架橋とも大きな蛋白質アセンブリ20の多くの構造研究で採用された正常に。
そのまま蛋白質複合体 (‘native’ 質量分析法とも呼ばれます)、その一方で、質量は、ペプチドにタンパク質とタンパク質加水分解なしの分析を含みます。組成、不均一性、化学量論、トポロジ、およびタンパク質複合体21,22のサブユニットの相互作用を明らかにします。イオン移動度と組み合わせて、さらにネイティブの質量はその構造23,24の決定をことができます。これは従来構造技術によって評価しにくいタンパク質複合体の構造の調査のための強力なツールになります。ただし、ネイティブの質量分析法は、エレクトロ スプレー イオン化の間に非共有結合蛋白質の相互作用を管理する分析バッファーを必要があります。これは通常アンモニウム酢酸25など水の揮発性のバッファーを使用して実現されます。さらに、楽器の変更が質量分析計26の気相に伝達の間に解離を防ぐために必要です。この方法で適用すると、多くの (大) 蛋白質の複合体を行った。印象的な例は、そのままリボゾーム27、ATP 合成酵素28、またはウイルス29の研究です。
ネイティブの質量と架橋の組み合わせを前の研究で特に成功した証明しました。予想外の Hsp70 ダイマーを含むシャペロン複合体の結果がそのまま蛋白質の複合体の質量分析実験から取得でした化学架橋の蛋白質の手配を明らかにしながら、例えば、アセンブリの30,31。別の研究では、複雑なそのまま ATP のシンターゼのポスト翻訳の修正の効果を調べた。ネイティブの質量分析法は、リン酸化やアセチル化32,33の有無でタンパク質の複雑な安定性への洞察を提供しました。比較架橋戦略34は、異なる条件の下で複雑な蛋白質の構造変化を明らかにしました。
ここでは、質量分析法、(化学) 架橋とデータ分析と解釈 (図 1) を含むネイティブの質量分析法によるタンパク質同定のプロトコルをいたします。2 つのよ特徴付けられたタンパク質複合体の助けを借りて、これらのメソッドから取得した相補的な結果の組み合わせは実証35です。我々 のプロトコルは、特定の純度と濃度に精製することができます任意の蛋白質のアセンブリに適用できます。アプローチはデータ解析データ、すなわちデータベースのサイズを架橋による限られたいくつかのケースで採用、必要な検索空間と時間を決定します。さらに、識別されたクロスリンクの手動の検証が必要、さらに出力を低減します。ネイティブの質量分析、サンプルの質、例えばバッファー制限は主、付加体の水溶液と揮発性のバッファーによって交換する浄化と可能性の時に使用します。ただし、通常構造の分析のための精製タンパク質複合体は私達のプロトコルの解析に成功に必要な品質を持っています。
プロトコルは、複数のサブユニット蛋白質の複合体の質量分析を用いた構造解析のため提供しています。プロトコルで説明されている 2 つの手法は、主に相補的な結果を提供し、タンパク質でアレンジを構造に洞察力を得るために適しています (-配位子) 錯体従来構造技術によって研究することは困難であります。ネイティブの質量分析法は、subcomplexes と安定した相互作用モジュールを分析することによってタンパク質の結果として蛋白質の相互作用についての洞察を提供します。架橋、その一方で、直接連絡先のサイト上の情報が得られます。によって使用される架橋剤、特定の柔軟性またはできます分析に含まれるべきであります。
指定されたプロトコルは、一般的に簡単に実行でき、ない時間がかかる。全体のプロトコルは、一週間内で実行することができます、タンパク質複合体量は解析に成功に必要なほぼすべてのタンパク質にも適用できます。サンプル準備は簡単、特に精製したタンパク質複合体を必要としません。ただし、1 つの一般的な落とし穴は、質量分析を用いたタンパク質の同定のための試料調製中のサンプルの汚染です。ほとんどの場合これらの汚染には、ほこり、皮膚や髪から由来するケラチンが含まれます。したがって、手袋、白衣を着てなど余分なケアは、水性バッファーをろ過、高純度溶剤を使用べきである質量分析を用いたタンパク質の同定のためのサンプル準備の間。シャペロンなど他の汚染タンパク質は、親和性の札を使用するとき通常例えば蛋白質の浄化の時に紹介しています。これらのケースで蛋白質の浄化によって改善されるべき、例えば洗濯ステップ数を増やします。いずれの場合も、サンプルの蛋白質汚染容易に識別データベース検索時に分類フィルターを省略することによって (すなわち、すべての種からの蛋白質に対する検索)。場合にのみ、いくつかのペプチドが観察される (すなわち、低たんぱくのカバレッジが得られて) にもかかわらず、十分なサンプルがあり、消化中に異なるプロテアーゼを使用する必要があります。一般的にトリプシンを生成ペプチド; の十分な数しかし、膜タンパク質や膜タンパク質のドメインなどのいくつかの場合、トリプシンの切断点の数を減少、他のターゲットに疎水性アミノ酸の酵素がより良い選択。
計測、面で特に変更された楽器はネイティブ質量気相への移動中に非共有結合相互作用を維持するために必要。Q ToF および orbitrap 楽器を含む、いくつかの楽器の種類が紹介されています。変更 Q ToF 質量分析計は数年からネイティブの質量分析用市販、後者は最近導入され、ほとんどの場合必要があります専門の変更45。しかし、高解像度機器のアプリケーションは複数の配位子とその定量化46,47のバインディングを勉強できる、有望な将来のアプリケーションです。
液体クロマトグラフィー質量分析法による架橋・ ディ ・ ペプチドを識別するためにいくつかの変更と標準的な手順を適用できます。ただし、データベース検索は、制限の要因として、専用のソフトウェアが大規模なデータベースを扱うことがめったとの複合体の蛋白質の亜単位を含んでいる減らされたデータベースが必要です。近年使用される質量分析法による劈開ゲルビーズ全体のセル lysates48,49で蛋白質の相互作用を対象とします。タンデム質量分析の実験でフラグメントの主化学ゲルビーズの使用線形ペプチド (、架橋剤によって変更)、それ以上の分裂によって識別することができますを生成し、線形ペプチドおよびこれのデータベース検索を低減時間と計算検索空間を検索します。しかし、これらの実験を実行するイオン トラップ質量分析計またはイオン トラップを用いたハイブリッド質量分析計です。一般に、偽陽性は重要な問題、架橋ペプチドの質量スペクトルがしばしば手動でデータ解析時間が非常に長く、そのフラグメント スペクトルの質によってに検証されます。さらに検証手順、したがって潜在的な将来のアプリケーションなしに適用できる堅牢なスコアリング システムの開発。データ分析が向上し、偽陽性の数を減らす 1 つの方法は、偽の発見率の計算とデータ セット50を架橋への応用の紹介をされました。
さらに質量分析技術一般に、ここで説明したテクニックで補完することができます (例えば、共有ラベル) 解析からの出力を増加させる。その他の変更とプロトコルの改善は簡単に実装できます。よう比較架橋34は蛋白質の集合の構造変化を解きます。ネイティブの質量分析法のさらなる発展は最近膜蛋白質51,52の解析、脂質28,52,53,54との相互作用を許可します。.ネイティブの質量分析のための高分解能質量分析計の新展開アプリケーションとリガンド結合、例えば脂質膜蛋白質への結合を拡張、今解析45,に含まれることができます。46. 計算モデル化のアプローチと組み合わせて、これらの技術は可変解像度55の構造モデルを提供できます。そのまま複雑なまたは 1 つのサブユニットの結晶構造がない場合、質量分析は蛋白質の相互作用および未知の複雑なトポロジに最初の洞察力を提供できます。不明な複合体の低解像度のモデルによって使用される技術と得られた結果、56,57,58得られます。結晶構造やホモロジー モデルがある場合、質量分析法の構造情報もネイティブに近いモデル59をもたらすことができます。
質量分析法による他の構造技術と比較して利点がある、濃度の低いサンプルが必要です、それは異種のサンプルを扱うことが、蛋白質の複合体のサイズが無制限に適用できます。さらに、質量分析は蛋白質の動的なシステムの調査をことができます。ソリューション内に存在するタンパク質やタンパク質複合体の異なった人口が通常一緒に分析され、そのためとは異なり特定の集団の選択を必要とする他の構造技術とすべての立体構造中が維持されます。分析とは、1 つの実験で課税。定量的な架橋方法は最近導入された34,60,61有望な将来のアプリケーションをさまざまな条件下での構造変化を記述します。
The authors have nothing to disclose.
役に立つ議論の仲間たちに感謝いたします。我々 はまた蛋白質の複合体を提供するためイルメ シュリヒティングとカール ・ ピーター Hopfner をありがちましょう。我々 は、教育と研究のための中央政府大臣からの資金調達を認める (BMBF、ZIK プログラム、03Z22HN22)、欧州地域開発基金 (EFRE、ZS/2016/04/78115) と c. s.、Wellcome の信頼 (109854/658 から資金に MLU ハレ ・ ヴィッテンベルクZ/15/Z) を兼
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |