L’architettura dei complessi della proteina è essenziale per la loro funzione. Combinando varie tecniche di spettrometrihe di massa ha dimostrato potente per studiare il loro assemblaggio. Forniamo i protocolli per reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa e mostrare come queste tecniche complementari consentono a delucidare l’architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina.
Le proteine interagiscono con i loro ligandi agli assembly attiva e dinamica della forma che svolgono varie funzioni cellulari. Delucidamento queste interazioni è quindi fondamentale per la comprensione dei processi cellulari. Tuttavia, molti complessi proteici sono assembly dinamici e non sono accessibili mediante tecniche strutturali convenzionali. Spettrometria di massa contribuisce all’indagine strutturale di queste assemblee, e in particolare la combinazione di varie tecniche di spettrometrihe di massa fornisce informazioni preziose nella loro disposizione strutturale.
In questo articolo, descriviamo l’applicazione e la combinazione di due tecniche complementari di spettrometrihe di massa, vale a dire reticolazione chimica accoppiato con spettrometria di massa e spettrometria di massa nativa. Cross-linking chimico coinvolge il legame covalente di aminoacidi nelle immediate vicinanze utilizzando reagenti chimici. Dopo digestione con le proteasi, reticolato di-peptidi sono identificati mediante spettrometria di massa e siti di interazioni di proteine sono scoperti. Spettrometria di massa nativa è d’altra parte l’analisi degli assiemi di proteine intatte in fase gassosa di uno spettrometro di massa. Esso rivela stoichiometries proteina così come interazioni proteina e ligando. Entrambe le tecniche pertanto forniscono informazioni complementari sulla struttura della proteina-ligando assembly e loro combinazione si è rivelata potente negli studi precedenti.
L’indagine strutturale degli assembly di proteina è diventato particolarmente importante per la comprensione dei processi cellulari. Di conseguenza, molti, tecniche sviluppate e migliorate in biologia strutturale1. Tuttavia, queste tecniche a volte sono limitate nella loro applicazione a causa della dimensione, flessibilità o eterogeneità dei complessi della proteina in esame. Spettrometria di massa può affrontare queste sfide e, di conseguenza, è emerso come un potente strumento in biologia strutturale2,3,4,5. Il grande vantaggio di spettrometria di massa, tuttavia, è la capacità di identificare inequivocabilmente proteine anche in miscele complesse ed eterogenee6. A tal fine, proteine solitamente vengono digerite con endoproteinases e la miscela peptidica risultante è separata mediante cromatografia liquida ed eluita direttamente nello spettrometro di massa. Le masse del peptide sono successivamente determinate e ioni precursori sono stati selezionati per ulteriore frammentazione dei peptidi. Le proteine sono quindi identificate di ricerca peptide e corrispondente frammento masse contro un database conosciuto. Questa procedura consente non solo l’identificazione di peptidi e proteine, ma anche loro modificazioni post-traduzionali che causano uno spostamento di massa di peptidi precursori e gli ioni frammento che trasportano la modifica7. Alcune delle molte tecniche di spettrometria di massa strutturale si basano su questo principio4,8. Per esempio, etichettatura tecniche quali idrogeno deuterio cambio9,10, chimica d’etichettatura strategie11,12, o radicale ossidrile piede stampa13,14 , dare spunti l’accessibilità superficiale delle proteine in determinate condizioni.
Un’altra tecnica è (chimica), cross-linking che coinvolge il legame covalente di aminoacidi in prossimità attraverso loro gruppi funzionali. Per questo, reagenti chimici, UV-activatable reagenti o gli aminoacidi sono impiegati15,16. Dopo cross-linking, le proteine sono solitamente idrolizzate con le proteasi e reticolato di-peptidi sono analizzati mediante spettrometria di massa accoppiata di cromatografia liquida. L’identificazione dei prodotti cross-linking di database di ricerca, tuttavia, richiede l’uso di software specializzato che concatenare sequenze peptidiche di varie proteine e regioni più disparate17,18,19. L’uso di linkers chimica ha il vantaggio che può essere impiegato per quasi ogni complesso di proteine di interesse e non richiede l’incorporazione di UV-activatable amino acidi, che può essere raggiunto solo quando esprimenti la proteina di interesse in cellule ospiti. Come tale, cross-linking è uno strumento versatile ed è stato impiegato con successo in molti studi strutturali di proteine anche grandi assemblee20.
Spettrometria di massa di complessi di proteine intatte (a volte chiamato “nativa” spettrometria di massa), d’altra parte, comporta l’analisi di proteine intatte e complessi proteici senza idrolisi in peptidi. Esso rivela la composizione, eterogeneità, stechiometria, topologia e interazioni di subunità della proteina complessi21,22. In combinazione con mobilità dello ione, spettrometria di massa nativa ulteriormente consente la determinazione del loro conformazione23,24. Questo lo rende un potente strumento per l’indagine strutturale dei complessi della proteina che sono difficili da valutare mediante tecniche strutturali convenzionali. Tuttavia, spettrometria di massa nativa richiede buffer di analisi che mantenere interazioni non-covalenti proteina durante la ionizzazione electrospray. Normalmente ciò viene ottenuto utilizzando tamponi acquosi, volatili come ammonio acetato25. Inoltre, strumento modifiche sono necessarie per impedire la dissociazione durante la trasmissione in fase gassosa di spettrometro di massa26. Applicato in questo modo, molti complessi proteici (grande) sono stati analizzati. Gli esempi impressionanti sono gli studi di ribosomi intatto27, ATP sintasi28o virus29.
La combinazione di spettrometria di massa nativa e cross-linking si è rivelata particolarmente riuscita negli studi precedenti. Per esempio, il stoichiometries dei complessi di chaperone, tra cui un dimero di Hsp70 imprevisto, potrebbe essere ottenuta da esperimenti di spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta, mentre la reticolazione chimica ha rivelato il regime delle proteine nella gli assembly30,31. In uno studio differente, sono stati studiati gli effetti delle modificazioni post-traduzionali su un intatto trifosfato di adenosina synthase complesso. Spettrometria di massa nativa fornito le comprensioni nella stabilità del complesso della proteina in presenza o assenza di fosforilazione o acetilazione32,33. Un comparativo cross-linking strategia34 poi rivelato cambiamenti conformazionali della proteina complessa nelle diverse condizioni.
Qui, forniamo i protocolli per l’identificazione di proteine di spettrometria di massa, cross-linking (chimica) e spettrometria di massa nativa, tra cui l’analisi dei dati e interpretazione (Figura 1). La combinazione di risultati complementari ottenuti da questi metodi con l’aiuto di due complessi di proteine ben caratterizzati è dimostrata35. Il nostro protocollo può essere applicato a qualsiasi assembly di proteina che può essere purificato a certa purezza e concentrazione. L’approccio è in alcuni casi limitati dalla analisi dei dati di cross-linking dei dati, vale a dire, la dimensione del database impiegato, che determina la necessaria ricerca spazio e nel tempo. Inoltre, convalida manuale di legami incrociati identificati è richiesto spesso e riduce ulteriormente l’output. Spettrometria di massa nativa è limitata principalmente dalla qualità del campione, per esempio, buffer e addotti utilizzato durante la purificazione e la possibilità di scambiarli da tamponi acquosi e volatili. Tuttavia, complessi proteici purificati per l’analisi strutturale di solito hanno la qualità richiesta per l’analisi di successo con i nostri protocolli.
Sono disponibili protocolli per l’analisi strutturale basati sulla spettrometria di massa dei complessi multi-subunità della proteina. Le due tecniche, descritte nel protocollo, per lo più fornire risultati complementari e sono particolarmente adatte per acquisire conoscenze in dispositivi strutturali all’interno della proteina (-ligando) complessi che sono difficili da studiare mediante tecniche strutturali convenzionali. Spettrometria di massa nativa offre intuizioni stoichiometries proteina così come interazioni proteina analizzando subcomplexes e moduli di interazione stabile. Cross-linking, d’altra parte, produce informazioni sui siti di contatto diretti. A seconda il reticolante utilizzato, una certa flessibilità possa o deve essere inclusi nell’analisi.
I protocolli forniti sono in generale facile da eseguire e non richiede molto tempo. L’intero protocollo può essere eseguito entro una settimana e può essere applicato a quasi tutti i complessi della proteina, anche se una certa quantità di complesso proteico è necessaria per l’analisi di successo. Preparazione del campione è semplice e non richiede specificamente complessi della proteina purificata. Tuttavia, un problema comune è contaminazione del campione durante la preparazione dei campioni per l’identificazione di proteine basati sulla spettrometria di massa. Queste contaminazioni nella maggior parte dei casi includono le cheratine che provengono dalla polvere, dalla pelle o capelli. Di conseguenza, come ad esempio indossare guanti e camici da laboratorio, filtrazione amplificatori acquosi e l’utilizzo di solventi ad alta purezza dovrebbe prestare durante la preparazione dei campioni per l’identificazione di proteine basati sulla spettrometria di massa. Altre proteine contaminanti come chaperoni solitamente vengono introdotti durante la purificazione della proteina, per esempio, quando si utilizzano tag di affinità. In questi casi, purificazione della proteina dovrebbe essere migliorata, ad esempio aumentando i passaggi del lavaggio. In ogni caso, contaminazioni di proteina nel campione sono facilmente identificabili durante la ricerca nel database omettendo il filtro tassonomia (cioè, ricerca contro proteine da tutte le specie). Se solo si osservano alcuni peptidi (cioè, una copertura povera in proteine poteva essere ottenuta), anche se campione sufficiente è disponibile, potrebbe essere necessario utilizzare una proteinasi differente durante la digestione. In generale la tripsina produce un numero sufficiente di peptidi; Tuttavia, in alcuni casi ad esempio proteine di membrana o domini di membrana di proteine, viene ridotto il numero di siti di fenditura triptica e altri enzimi aminoacidi idrofobici di targeting sono una scelta migliore.
In termini di strumentazione, uno strumento particolarmente modificato è richiesto per spettrometria di massa nativa che mantiene le interazioni non-covalenti durante il trasferimento in fase gassosa. Sono stati introdotti diversi tipi di strumenti, compresi gli strumenti Q-ToF e orbitrap. Mentre modificati spettrometri di massa Q-ToF sono commercialmente disponibili per spettrometria di massa nativa da diversi anni, quest’ultimo solo di recente sono stati introdotti e nella maggior parte dei casi richiede modifiche specializzato45. Tuttavia, l’applicazione di strumenti ad alta definizione ha permesso di studiare il legame di ligandi più e loro quantificazione46,47 ed è promettente per applicazioni future.
Per identificare reticolato di-peptidi tramite spettrometria di massa ad accoppiamento cromatografia liquida, possono essere applicate le procedure standard con alcune modifiche. Tuttavia, la ricerca del database è il fattore limitante come software specializzato può raramente a che fare con database di grandi dimensioni e ridotto i database contenenti la subunità proteiche dei complessi sono obbligatori. Gli studi recenti usato massa spettrometria-spaccabili linkers targeting interazioni proteina intera cella lisati48,49. L’uso di linkers chimica che frammentano in esperimenti di spettrometria di massa tandem principalmente produce peptidi lineari (modificati dal reticolante), che possono essere identificati da un’ulteriore frammentazione e ricerca database di peptidi lineari e questo riduce tempo di ricerca e spazio di ricerca computazionale. Tuttavia, per eseguire questi esperimenti, un analizzatore di massa a trappola ionica o uno spettrometro di massa ibrido con una trappola ionica è necessario. In generale, come falsi positivi sono una questione importante, spettri di massa dei peptidi reticolati spesso vengono convalidati manualmente dalla qualità dei loro spettri di frammento che estende enormemente il tempo di analisi di dati. Lo sviluppo di robusti sistemi di punteggio che possono essere applicati senza ulteriori passaggi di convalida sono pertanto possibili applicazioni future. Un modo per migliorare l’analisi dei dati e per ridurre il numero di falsi positivi è stata l’introduzione di calcoli di tasso di falsi scoperta e la loro applicazione al cross-linking di insiemi di dati50.
In generale, le tecniche qui descritte possono essere integrate con ulteriori tecniche di spettrometria di massa (ad es., etichettatura covalente) per aumentare l’output di analisi. Altre modifiche e miglioramenti dei protocolli possono essere facilmente implementati. Come tale comparativo cross-linking34 si dipana cambiamenti conformazionali nell’assembly della proteina. Ulteriori sviluppi nella spettrometria di massa nativo oggi permettono l’analisi delle proteine della membrana51,52 e loro interazioni con i lipidi28,52,53,54 . Nuovi sviluppi di spettrometri di massa ad alta risoluzione per nativo spettrometria di massa hanno esteso l’applicazione e grippaggio del ligand, ad es., associazione dei lipidi alle proteine della membrana, ora possono essere inclusi nella analisi45, 46. in combinazione con approcci di modellazione computazionale, queste tecniche possono fornire modelli strutturali di diversa risoluzione55. Se nessuna struttura di cristallo è disponibile per le subunità di complesse o singole intatte, spettrometria di massa è in grado di fornire approfondimenti prime di interazioni della proteina e la topologia del complesso sconosciuto. A seconda delle tecniche utilizzate e i risultati ottenuti, modelli a bassa risoluzione del complesso sconosciuto possono essere ottenuti56,57,58. Se sono disponibili strutture cristalline o modelli di omologia, le informazioni strutturali ricevute dalla spettrometria di massa possono produrre anche quasi nativa modelli59.
Rispetto ad altre tecniche strutturali, spettrometria di massa ha il vantaggio che esso richiede una quantità di campione basso, si può trattare con campioni eterogenei ed è applicabile ai complessi della proteina di dimensioni illimitate. Inoltre, spettrometria di massa permette l’indagine di sistemi proteici dinamico. Diverse popolazioni della proteina o proteina complessa che esistono in soluzione solitamente vengono analizzati insieme e di conseguenza, a differenza con altre tecniche strutturali che richiedono la selezione di alcune popolazioni, tutte le conformazioni vengono mantenute durante analisi e sono valutabile in un esperimento. Approcci quantitativi di cross-linking sono stati recentemente introdotti34,60,61 e sono promettenti per applicazioni future che descrivono cambiamenti conformazionali in condizioni diverse.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i colleghi per utili discussioni. Ringraziamo anche Ilme Schlichting e Karl-Peter Hopfner per la fornitura di complessi proteici. Riconosciamo che il finanziamento dal Ministero federale per formazione e ricerca (BMBF, ZIK programma, 03Z22HN22), il Fondo europeo di sviluppo regionale (EFRE, ZS/2016/04/78115) e il MLU Halle-Wittenberg per C.S. e finanziamenti dal Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) per A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |