De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.
Eiwitten interactie met hun liganden voor vorm-actieve en dynamische samenstellen die verschillende cellulaire functies uitvoeren. Deze interacties ophelderen is daarom van fundamenteel belang voor het begrijpen van cellulaire processen. Zijn dynamische assemblages echter veel eiwitcomplexen en zijn niet toegankelijk door conventionele structurele technieken. Massaspectrometrie draagt bij aan het structurele onderzoek van deze vergaderingen, en met name de combinatie van diverse massaspectrometrische technieken levert waardevolle inzichten in hun structurele regeling.
In dit artikel beschrijven we de toepassing en de combinatie van twee complementaire massaspectrometrische technieken, namelijk chemische dwarsbinding gekoppeld aan massaspectrometrie en inheemse Spectrometrie van de massa. Chemische dwarsbinding betekent de covalente binding van aminozuren in de nabijheid met behulp van chemische reagentia. Na de spijsvertering met proteasen, kruislings gekoppelde di-peptiden zijn geïdentificeerd door massaspectrometrie en eiwit interacties sites zijn ontdekt. Native Spectrometrie van de massa is aan de andere kant de analyse van intacte eiwitten assemblages in de gasfase van een massaspectrometer. Het openbaart eiwit stoichiometries evenals eiwitten en ligand interacties. Beide technieken leveren daarom aanvullende informatie over de structuur van het eiwit-ligand verzamelingen en hun combinatie bewezen krachtige in eerdere studies.
Het structurele onderzoek van eiwit assembly’s is bijzonder belangrijk voor het begrijpen van cellulaire processen geworden. Bijgevolg, veel, technieken zijn ontwikkeld en verbeterd in structurele biologie1. Deze technieken zijn echter soms beperkt in hun toepassing als gevolg van de heterogeniteit van de eiwitcomplexen onderzochte, grootte en flexibiliteit. Massaspectrometrie kan omgaan met deze uitdagingen en daarom, naar voren gekomen als een krachtig instrument in structurele biologie2,,3,,4,5. Het grootste voordeel van de Spectrometrie van de massa, is echter de mogelijkheid om proteïnen zelfs in complexe en heterogene mengsels6ondubbelzinnig te identificeren. Te dien einde eiwitten zijn meestal verteerd met endoproteinases en het resulterende mengsel van peptide is gescheiden door vloeistofchromatografie en rechtstreeks in de massaspectrometer geëlueerd. Peptide massa’s worden vervolgens vastgesteld en voorloper ionen zijn geselecteerd voor verdere versnippering van de peptiden. Eiwitten worden vervolgens geïdentificeerd door zoeken peptide en overeenkomstige fragment massa’s tegen een bekend database. Deze procedure kunt niet alleen de identificatie van peptiden/eiwitten maar ook hun posttranslationele modificaties die leiden tot een massale verschuiving van de voorloper van peptiden en de uitvoering van de wijziging7fragment-ionen. Sommige van de vele technieken in structurele massaspectrometrie zijn gebaseerd op dit principe4,8. Bijvoorbeeld, voet labeling technieken zoals waterstof: deuterium exchange9,10, chemische labeling strategieën11,12, of hydroxyl radicaal afdrukken13,14 , geven inzicht in de oppervlakte toegankelijkheid van de eiwitten onder bepaalde voorwaarden.
Een andere techniek is (chemische) dwarsbinding waarbij de covalente binding van aminozuren in de nabijheid door hun functionele groepen. Hiervoor zijn chemische reagentia, UV-gevechts reagentia of aminozuren werknemer15,16. Na de cross-linking, de eiwitten zijn meestal gehydrolyseerd met proteasen en kruislings gekoppelde di-peptiden zijn geanalyseerd door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie. De identificatie van producten van de cross-linking door database zoeken, echter, vereist het gebruik van gespecialiseerde software die aaneenschakelen peptide reeksen van verschillende eiwitten en uiteenlopende regio’s17,18,19. Het gebruik van chemische cross-linkers heeft het voordeel dat het kan worden gebruikt om bijna elk eiwit complex van belang en vereist geen opneming van UV-gevechts aminozuren, die alleen bereikt kan worden als uiting van de proteïne van belang in de cellen van de gastheer. Als zodanig, dwarsbinding is een veelzijdig instrument en werd met succes werkzaam in vele structurele studies van zelfs grote eiwit assemblages20.
De Spectrometrie van de massa van intact eiwitcomplexen (soms genoemd ‘native’ massaspectrometrie), aan de andere kant, omvat de analyse van intacte eiwitten en eiwitcomplexen zonder hydrolyse in peptiden. Het openbaart samenstelling, heterogeniteit stoichiometrie, topologie en subeenheid interacties van eiwit complexen21,22. In combinatie met ion mobiliteit kunt inheemse massaspectrometrie verder bepaling van hun conformatie23,24. Dit maakt het een krachtig hulpmiddel voor het structurele onderzoek van eiwitcomplexen, die moeilijk te beoordelen door conventionele structurele technieken. Native massaspectrometrie vereist echter analyse buffers, die niet-covalente eiwitinteractie tijdens electrospray ionisatie handhaven. Dit wordt meestal bereikt met behulp van waterige, vluchtige buffers zoals ammonium acetaat25. Daarnaast, zijn instrument wijzigingen noodzakelijk om te voorkomen dat dissociatie tijdens de overdracht in de gasfase van de massaspectrometer26. Op deze wijze wordt toegepast, werden veel (grote) eiwitcomplexen geanalyseerd. Indrukwekkende voorbeelden zijn de studies van intact ribosomen27, ATP synthases28of virussen29.
De combinatie van inheemse Spectrometrie van de massa en dwarsbinding bijzonder succesvol in eerdere studies gebleken. Bijvoorbeeld, de stoichiometries van de Chaperon complexen, met inbegrip van een onverwachte Hsp70 dimeer, kon worden verkregen uit experimenten van de Spectrometrie van de massa van de intact eiwitcomplexen, terwijl chemische dwarsbinding geopenbaard de regelingen van de eiwitten in de assembly’s30,31. In een andere studie, werden de effecten van posttranslationele modificaties op een intact ATP-synthase complex bestudeerd. Native massaspectrometrie verschaft inzicht in de complexe eiwitstabiliteit in de aanwezigheid of afwezigheid van fosforylering of acetylation32,33. Een vergelijkende cross-linking strategie34 bleek vervolgens conformationele wijzigingen van het eiwit complex onder de verschillende omstandigheden.
Hier bieden wij de protocollen voor eiwit identificatie door massaspectrometrie (chemische) dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie, met inbegrip van data-analyse en interpretatie (Figuur 1). De combinatie van aanvullende resultaten verkregen uit deze methoden met behulp van twee goed gekarakteriseerd eiwitcomplexen is aangetoond dat35. Ons protocol kan worden toegepast op elke proteïne-assemblage die kan worden gezuiverd op bepaalde zuiverheid en concentratie. De aanpak is in sommige gevallen beperkt door data-analyse van gegevens, dat wil zeggen, de grootte van de database dwarsbinding werkzaam, die bepaalt dat de vereiste zoekruimte en tijd. Daarnaast handmatige validatie van geïdentificeerde cross-links wordt vaak vereist en verder beperkt de uitvoer. Native massaspectrometrie wordt meestal beperkt door de kwaliteit van de steekproef, bijvoorbeeld, buffers en adducten gebruikt tijdens de reiniging en de mogelijkheid om te wisselen ze door waterige en vluchtige buffers. Eiwitcomplexen gezuiverd voor structurele analyse meestal wel de vereiste voor succesvolle analyse met onze protocollen kwaliteit.
Protocollen zijn voorzien van massa spectrometrie gebaseerde structuuranalyse van multi subeenheid eiwitcomplexen. De twee technieken, beschreven in het protocol, meestal aanvullende resultaten en zijn zeer geschikt inzichten te krijgen in de structurele regelingen binnen eiwit (-ligand) complexen die moeilijk te bestuderen door conventionele structurele technieken. Native massaspectrometrie levert inzicht in eiwit stoichiometries evenals eiwitinteractie door het analyseren van subcomplexes en stabiele interactie modules. Cross-linking, aan de andere kant, levert informatie op directe contact sites. Afhankelijk van de cross-linker gebruikt, een zekere flexibiliteit kan of moet worden opgenomen in de analyse.
De meegeleverde protocollen zijn in het algemeen gemakkelijk uit te voeren en niet tijdrovend. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd binnen een week en kan worden toegepast op vrijwel alle eiwitcomplexen, hoewel, een bepaalde hoeveelheid het eiwit complex vereist is voor succesvolle analyse. Bereiding van de monsters is eenvoudig en vereist geen specifiek gezuiverde eiwitcomplexen. Één gemeenschappelijke pitfall is echter een besmetting van het monster tijdens de bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde eiwit identificatie. Deze verontreinigingen in de meeste gevallen omvatten keratines, die afkomstig van stof, huid of haar zijn. Daarom, extra zorg zoals het dragen van handschoenen en Labjassen, filtrating waterige buffers, en het gebruik van hoge zuiverheid oplosmiddelen moeten worden genomen tijdens de bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde eiwit identificatie. Andere contaminerende eiwitten zoals chaperones zijn meestal geïntroduceerd tijdens EiwitReiniging, bijvoorbeeldbij het gebruik van affiniteit tags. In deze gevallen moet eiwitreiniging worden verbeterd, bijvoorbeeld door het verhogen van wassen stappen. In ieder geval eiwit verontreinigingen in de steekproef tijdens de database zoeken gemakkelijk worden geïdentificeerd door het weglaten van de taxonomie-filter (dat wil zeggen, zoeken tegen proteïnen van alle soorten). Als slechts een paar peptiden in acht worden genomen (d.w.z., de dekking van een laag eiwitgehalte kan worden verkregen), ook al voldoende monster beschikbaar is, kan het nodig zijn om te gebruiken een verschillende proteïnase tijdens de vertering. In het algemeen levert trypsine een voldoende aantal peptiden; echter in sommige gevallen zoals membraaneiwitten of membraan domeinen van eiwitten, het aantal al decollete sites wordt verminderd en andere enzymen gericht op hydrofobe aminozuren zijn een betere keuze.
Op het gebied van instrumentatie is een bijzonder gewijzigde instrument vereist voor inheemse massaspectrometrie die beweert van niet-covalente interacties tijdens de overdracht in de gas-fase. Instrument verschillende bijgekomen, waaronder Q-ToF en orbitrap instrumenten. Terwijl gemodificeerde Q-ToF massaspectrometers commercieel beschikbaar zijn voor native massaspectrometrie sinds verscheidene jaren, de laatste pas onlangs zijn geïntroduceerd en in de meeste gevallen vereisen gespecialiseerde wijziging45. Echter de toepassing van hoge resolutie instrumenten mogen studeren binding van meerdere liganden en hun kwantificering46,47 en is veelbelovend voor toekomstige toepassingen.
Als u wilt identificeren kruislings gekoppelde di-peptiden door vloeibare chromatografie-gekoppelde massaspectrometrie, kunnen standaardprocedures met enkele wijzigingen worden toegepast. Echter, de database zoeken is de beperkende factor als gespecialiseerde software kan zelden omgaan met grote databases en verminderde databases met de eiwit subeenheden van de complexen zijn vereist. Recente studies gebruikt massa spectrometrie-cleavable cross-linkers eiwitinteractie in hele cel lysates48,49richt. Het gebruik van chemische cross-linkers dat in tandem massaspectrometrie experimenten meestal fragment levert lineaire peptiden (gewijzigd door de cross-linker), die kunnen worden geïdentificeerd door verdere versplintering en database zoeken van lineaire peptiden, en dit vermindert zoektijd en computationele zoekruimte. Echter, voor het uitvoeren van deze experimenten, een massale analysator van ion trap of een hybride massaspectrometer met een ion trap is vereist. In het algemeen, zijn vals-positieven zijn een belangrijke kwestie, massaspectra van kruislings gekoppelde peptiden vaak gevalideerd handmatig door de kwaliteit van hun fragment spectra die gegevens analyse tijd enorm uitbreidt. Het ontwikkelen van robuuste scoren systemen die kunnen worden toegepast zonder verdere validatiestappen derhalve potentiële toekomstige toepassingen zijn. Unidirectioneel om data-analyse en het aantal vals-positieven te verminderen was de introductie van valse ontdekking tarief berekeningen en de toepassing ervan op datasets50dwarsbinding.
In het algemeen, de hier beschreven technieken kunnen worden aangevuld met verdere massaspectrometrie technieken (bijvoorbeeldcovalente labelen) te verhogen van de output van de analyse. Andere aanpassingen en verbeteringen van de protocollen kunnen gemakkelijk worden geïmplementeerd. Als zodanig ontrafelt vergelijkende cross-linking34 conformationele veranderingen in de vergadering van de eiwitten. Verdere ontwikkelingen in de inheemse massaspectrometrie toestaan tegenwoordig de analyse van membraan eiwitten51,52 en hun interacties met lipiden28,52,53,,54 . Nieuwe ontwikkelingen van high-resolution massaspectrometers voor inheemse massaspectrometrie hebben uitgebreid de toepassing en ligand bindende, bijvoorbeeld, binding van lipiden aan membraaneiwitten, kunnen nu worden opgenomen in de analyse45, 46. in combinatie met computationele modellering benaderingen, kunnen deze technieken leveren structurele modellen van verschillende resolutie55. Als geen kristalstructuren beschikbaar voor de intact complexe of één subeenheden zijn, kan massaspectrometrie leveren eerste inzichten in eiwit interacties en de topologie van het onbekende complex. Afhankelijk van de gebruikte technieken en de verkregen resultaten, kunnen met een lage resolutie modellen van het onbekende complex worden verkregen van56,57,58. Als kristalstructuren of homologie modellen beschikbaar zijn, kan de structuurgegevens van massaspectrometrie ontvangen zelfs in de buurt van-native modellen59opleveren.
In vergelijking met andere structurele technieken, massaspectrometrie heeft het voordeel dat het vereist lage monster bedragen, kan omgaan met heterogene monsters en is van toepassing op eiwitcomplexen van onbeperkte grootte. Verder, staat massaspectrometrie het onderzoek van dynamische eiwit systemen. Verschillende bevolkingsgroepen van het eiwit of eiwit complex die bestaan in oplossing meestal samen worden geanalyseerd en daarom, in tegenstelling tot met andere structurele technieken waarvoor selectie van bepaalde bevolkingsgroepen, alle conformaties worden gehandhaafd tijdens analyse en zijn verifieerbare in één experiment. Kwantitatieve cross-linking benaderingen werden onlangs geïntroduceerde34,60,,61 en zijn veelbelovend voor toekomstige toepassingen beschrijven conformationele wijzigingen onder verschillende omstandigheden.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken onze collega’s voor nuttige discussies. Wij danken ook Ilme Schlichting en Karl-Peter Hopfner voor het verstrekken van eiwitcomplexen. Wij erkennen dat financiering uit het federale ministerie voor onderwijs en onderzoek (goedgekeurd, ZIK programma, 03Z22HN22), de Europese regionale ontwikkelingsfondsen (EFRE, ZS/2016/04/78115) en de MLU Halle-Wittenberg C.S. en financiering van de Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) naar A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |