蛋白质复合体的结构对其功能至关重要。结合各种质谱技术证明了研究其组装的强大功能。我们提供化学交联和本机质谱的协议, 并展示这些互补技术如何帮助阐明 multi-subunit 蛋白组件的结构。
蛋白质与他们的配体相互作用形成活跃的和动态的组合, 执行各种细胞功能。因此, 阐明这些相互作用是理解细胞过程的基础。然而, 许多蛋白质复合体是动态组件, 不能通过传统的结构技术来获取。质谱分析有助于这些组件的结构研究, 特别是各种质谱技术的结合, 为它们的结构安排提供了宝贵的见解。
在本文中, 我们描述了两种互补质谱技术的应用和组合, 即化学交联结合质谱和本机质谱。化学交联是用化学试剂在近距离接触氨基酸的共价键。在消化与蛋白酶, 交联的 di 肽通过质谱和蛋白质相互作用站点被发现。在质谱仪的气相中, 对完整的蛋白质组合进行了分析。它揭示了蛋白质 stoichiometries 以及蛋白质和配体相互作用。因此, 这两种技术都提供了有关蛋白质-配体组件结构的补充信息, 并且在先前的研究中证明了它们的结合力。
蛋白质组装的结构研究对细胞过程的理解变得尤为重要。因此, 许多技术已经开发和改进的结构生物学1。然而, 这些技术有时是有限的, 因为其应用的大小, 灵活性, 或异质性的蛋白质复合物的调查。质谱法可以处理这些挑战, 因此, 成为一个强大的工具在结构生物学2,3,4,5。然而, 质谱法的最大优点是能够在复杂和异构混合物中明确识别蛋白质,6。为此, 蛋白质通常是用 endoproteinases 消化的, 由此产生的肽混合物通过液相色谱法分离, 直接洗到质谱仪中。肽质量随后被确定和前体离子被选择为进一步分裂的多肽。然后在已知的数据库中通过搜索肽和相应的片段质量来识别蛋白质。这个过程不仅允许识别多肽/蛋白质, 而且他们的修饰的修改, 导致前体肽和片段离子的大规模转移进行修改7。结构质谱中的许多技术都是基于这一原则4,8。例如, 标记技术如氢氘交换9,10, 化学标记策略11,12, 或羟基根脚打印13,14, 在一定条件下洞察蛋白质的表面可及性。
另一种技术是 (化学) 交联, 涉及氨基酸的共价键联系通过其功能组密切接近。为此, 化学试剂、UV 激活试剂或氨基酸被使用15,16。交联后, 通常用蛋白酶水解蛋白质, 用液相色谱-耦合质谱法分析交叉连接的 di 肽。通过数据库检索来识别交联产品, 但是, 需要使用专门的软件, 连接各种蛋白质和不同区域的肽序列17,18,19。使用化学 cross-linkers 的好处是, 它可以被用于几乎每一个感兴趣的蛋白质复合体, 不需要加入紫外线-激活氨基酸, 这只能实现时, 表达的蛋白质感兴趣的宿主细胞。因此, 交联是一个多才多艺的工具, 并成功地使用了许多结构研究, 甚至大型蛋白质组件20。
另一方面, 完整的蛋白质复合物的质谱学 (有时被称为 “本机质谱”), 涉及对完整的蛋白质和蛋白质复合物的分析而不水解为多肽。它揭示了蛋白质复合物的组成、异质性、化学计量、拓扑和亚基相互作用21,22。结合离子流动性, 本机质谱进一步允许确定其构象23,24。这使得它成为一个强有力的工具, 对蛋白质复合物的结构研究, 难以评估传统的结构技术。然而, 本机质谱需要分析缓冲, 以保持价蛋白相互作用在电喷雾电离。这通常是通过使用水, 挥发性的缓冲区, 如醋酸铵25。此外, 仪器的修改是必要的, 以防止分离过程中传输到质谱仪的气相中26。应用这种方法, 对许多 (大) 蛋白复合物进行了分析。令人印象深刻的例子是研究完整的核糖体27, ATP 酶28, 或病毒29。
当地质谱和交联的结合在以前的研究中证明特别成功。例如, stoichiometries 的伴侣配合物, 包括一个意想不到的 Hsp70 二聚体, 可以获得从质谱实验的完整的蛋白质复合物, 而化学交联揭示了蛋白质的安排程序集30,31。在不同的研究中, 研究了修饰修饰对完整的 ATP 合酶复合体的影响。本机质谱法提供了洞察到蛋白质复合体的稳定性存在或缺乏磷酸化或乙酰性32,33。一个比较交联策略34然后揭示了蛋白质复合体在不同条件下的构象变化。
在这里, 我们提供的蛋白质鉴定的协议质谱, (化学) 交联, 和本机质谱, 包括数据分析和解释 (图 1)。在两个良好蛋白配合物的帮助下, 从这些方法中获得的互补结果的结合显示为35。我们的协议可以适用于任何蛋白质组装, 可以在一定纯度和浓度纯化。这种方法在某些情况下受交联数据的数据分析限制,即, 所使用的数据库的大小决定了所需的搜索空间和时间。此外, 通常需要手动验证已识别的交, 并进一步减少输出。本机质谱主要受样品质量的限制,例如, 在纯化过程中使用的缓冲器和加, 以及通过水和挥发性缓冲液交换它们的可能性。然而, 为结构分析纯化的蛋白质复合物通常具有成功分析我们的协议所需的质量。
为 multi-subunit 蛋白复合物的质量谱结构分析提供了协议。这两种技术, 在议定书中描述, 主要是提供互补的结果, 并非常适合于了解蛋白质 (-配体) 的结构安排, 这是很难用传统的结构技术研究。本机质谱分析亚和稳定的相互作用模块, 提供了对蛋白质 stoichiometries 以及蛋白质相互作用的洞察。另一方面, 交叉链接产生直接接触点的信息。根据所使用的交, 可以或应该在分析中包含一定的灵活性。
所提供的协议一般易于执行, 且不耗时。整个协议可以在一周内执行, 并且可以应用到几乎所有的蛋白质复合物, 虽然, 一定数量的蛋白质复合体是需要成功的分析。样品制备简单, 不需要特别纯化的蛋白质复合物。然而, 一个常见的缺陷是样品的污染在样品制备过程中的质量谱蛋白的鉴定。在大多数情况下, 这些污染物包括来自灰尘、皮肤或毛发的角。因此, 在样品制备过程中应特别注意佩戴手套和实验室大衣、过滤水缓冲液和使用高纯度溶剂, 以谱蛋白的鉴定。其他污染的蛋白质, 如伴侣, 通常在蛋白质纯化过程中被引入,例如, 在使用亲和标记时。在这些情况下, 应该改进蛋白质纯化, 例如通过增加洗涤步骤。在任何情况下, 在数据库搜索过程中, 通过省略分类过滤器 (即, 搜索所有物种的蛋白质), 可以很容易地识别样本中的蛋白质污染物。如果只观察到少量的肽 (即, 就可以获得低蛋白质覆盖率), 即使有足够的样本, 在消化过程中也可能需要使用不同的蛋白酶。在一般的胰蛋白酶产生足够多肽;然而, 在某些情况下, 如膜蛋白或膜领域的蛋白质, 胰裂解点的数量减少和其他酶靶向疏水性氨基酸是一个更好的选择。
在仪器仪表方面, 本机质谱仪是一种特别改装的仪器, 它在转移到气相中保持价的相互作用。介绍了几种仪器类型, 包括 Q 飞行和 orbitrap 仪器。虽然修改后的 Q 飞行时间质谱仪是商业可用于本地质谱自几年以来, 后者是最近才引入, 并在大多数情况下需要专门修改45。然而, 高分辨率仪器的应用允许研究多重配体的结合及其量化46,47 , 并有望用于将来的应用程序。
用液相色谱-耦合质谱法鉴定交联的 di 肽, 可采用少量修改的标准程序。然而, 数据库搜索是限制因素, 因为专业软件很少能处理大型数据库, 并且需要减少含有蛋白质亚基的数据库。最近的研究使用质谱-裂解 cross-linkers 靶蛋白相互作用在整个细胞裂解48,49。在串联质谱实验中使用化学 cross-linkers 的方法主要是产生线性多肽 (由交), 这可以通过进一步的分裂和线性肽的数据库搜索来识别, 这就减少了搜索时间和计算搜索空间。然而, 为了进行这些实验, 需要离子阱质量分析仪或带有离子阱的混合质谱仪。一般而言, 由于假阳性是一个重要的问题, 交联多肽的质谱往往通过其片段谱的质量来进行人工验证, 从而极大地延长了数据分析时间。因此, 在没有进一步验证步骤的情况下开发健壮的评分系统是未来的潜在应用。改进数据分析和减少误报次数的一种方法是引入错误发现率计算, 并将其应用于交联数据集50。
总的来说, 这里描述的技术可以通过进一步的质谱技术 (例如, 共价键标记) 来补充, 以增加分析的输出。协议的其他修改和改进可以很容易地实现。作为这样比较交联34揭开构象变化在蛋白质汇编。在本族质谱学的进一步发展现在允许分析膜蛋白51,52及其与血脂的相互作用28,52,53,54.本机质谱的高分辨率质谱仪的新发展扩展了应用和配体结合,例如, 脂类与膜蛋白的结合, 现在可以包括在分析中45,46. 与计算建模方法相结合, 这些技术可以提供不同分辨率55的结构模型。如果没有晶体结构可用于完整的复杂或单一的亚基, 质谱可以提供第一洞察到蛋白质相互作用和拓扑结构的未知的复杂。根据所使用的技术和所获得的结果, 可以获得未知复杂度的低分辨率模型56,57,58。如果有晶体结构或同源模型, 从质谱学得到的结构信息可以产生甚至接近本机模型59。
与其他结构技术相比, 质谱法具有要求样品量低的优点, 可以处理异质样品, 适用于无限大小的蛋白质配合物。此外, 质谱法允许研究动态蛋白质系统。在溶液中存在的蛋白质或蛋白质复合体的不同种群通常一起进行分析, 因此, 与其他需要选择某些种群的结构技术不同, 所有构象都在分析, 并在一个实验中被征税。定量交联方法最近被引入34,60,61 , 并有望用于描述不同条件下的构象变化的未来应用。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢我们的同事进行了有益的讨论。我们还感谢 Ilme Schlichting 和卡尔-彼得 Hopfner 提供蛋白质复合物。我们承认联邦教育和研究部 (BMBF、ZIK 方案、03Z22HN22)、欧洲区域发展基金 (EFRE、ZS/2016/04/78115) 和 MLU 哈雷-维滕贝格的资助和惠康信托基金 (109854/658Z/15/Z) 到美联社
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |