Summary

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Published: April 26, 2017
doi:

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de tejido gonadal de larvas de pez cebra, que facilitará las investigaciones de la diferenciación sexual de pez cebra y el mantenimiento.

Abstract

Aunque el pez cebra salvaje poseen un sistema de determinación del sexo / ZW ZZ, pez cebra domesticado han perdido el cromosoma sexual. Ellos utilizan un sistema de determinación del sexo poligénica, donde varios genes distribuidos en todo el genoma determinar colectivamente las identidades sexuales de peces individuales. Actualmente, los genes implicados en la regulación del desarrollo de las gónadas y cómo funcionan siendo difícil de alcanzar. Normalmente, el aislamiento de tejido gonadal es el primer paso para examinar los procesos de desarrollo de sexo. A continuación, presentamos un procedimiento para aislar el tejido gonadal de 17 dpf (días después de la fertilización) y 25 dpf larvas de pez cebra. El tejido gonadal aislado puede ser examinada posteriormente por la morfología y la expresión de genes de perfiles.

Introduction

El principal determinante del sexo femenino en salvaje cromosoma pez cebra 4 se pierde o se modifica en el pez cebra domesticado (es decir, las cepas de laboratorio comunes) 1. En cambio, tienen un sistema de determinación del sexo poligénica acompañado por factores ambientales como la temperatura, la hipoxia, la disponibilidad de alimentos y la densidad de población. Los mecanismos detallados del desarrollo sexual del pez cebra no se entienden completamente. Las preguntas fundamentales tales como cuando se produce la determinación del sexo de pez cebra, lo que es la señal de la determinación del sexo primario (s) / son, y que los genes regulan la primera etapa de transformación gónada siguen sin respuesta 2, 3.

En el proceso del desarrollo sexual de pez cebra, varias etapas importantes han sido reconocidos. En la etapa temprana de desarrollo, a partir de 4 hpf (horas después de la fecundación) germinales células primordiales (PGCs) someterse especificación, la migración a cresta genital yproliferación. Números PGC y las interacciones recíprocas entre las células germinales y las células somáticas son importantes para la diferenciación de las gónadas 4. A los 13 dpf (días después de la fertilización), las gónadas están en la etapa indiferenciada. Por 17 dpf, las gónadas se desarrollan en los ovarios bi-potenciales en las hembras y los machos futuras. La transición apoptosis dependiente de ovario al testículo comienzan a las 21 a 25 dpf y puede continuar durante varias semanas. Por 35 dpf, el sexo de la gónada se ha determinado y la producción de gametos específico del sexo está en marcha en ambos ovarios y testículos 5, 6, 7.

Hasta la fecha, se han propuesto diversos genes y mecanismos de determinación del sexo candidatos. Proteómica y análisis transcriptomic han aislado muchos genes con expresión dimorfismo sexual y estos genes se han utilizado para estudiar la diferenciación sexual en el pez cebra 8, </sup> 9, 10. Por ejemplo, en larvas de pez cebra, el gen cyp19a1a se expresa específicamente en el ovario pero no en el testículo 11, 12. Además, el gen AMH se expresa débilmente en las células del folículo de la granulosa de ovarios, pero fuertemente en los testículos células de Sertoli 13. En contraste, el gen vasa se expresa continuamente en las células germinales de ambos pez cebra hembra y macho, por lo que es un marcador gónada adecuado 14, 15.

Investigando gonadales niveles de expresión génica es fundamental para comprender el mecanismo molecular de la determinación del sexo y diferenciación especialmente en la etapa de ovario bi-potencial 3, 9. Sin embargo, el pequeño tamaño de larvas de pez cebra y correspondientemente pequeñas gónadas complicar el aislamiento de gónadal de tejido para análisis molecular más. Estudios previos utilizados diseccionaron región del tronco entero entre los opérculos y poro anal 16. Esta preparación, aunque gónadas contienen, consiste en múltiples tejidos y órganos. Alternativamente, los animales transgénicos con la expresión de GFP-gónada específica tales como vasa: EGFP se utilizaron para el aislamiento de tejido gonadal a través de células activadas por fluorescencia (FACS) y captura por láser micro-disección 17, 18. Sin embargo, su aplicación generalizada es limitado. A continuación, describimos un procedimiento simple para aislar el tejido gonadal de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. Se demuestra la posición de las gónadas con respecto a otros órganos y aislar las gónadas morfológicamente intactas de los tejidos circundantes. Además, muestran los genes-gónadas específicos tales como vasa y cyp19a1a son altamente expresado en las gónadas aisladas en comparación con el tejido del tronco a través de PCR cuantitativa (qPCR) análisis. El presente protocolo permite la identificación, aislamiento, purificación de ARN y amplificación de genes específicos gonadales de larvas de pez cebra, permitiendo de este modo posterior análisis molecular de tejido gonadal 19.

Protocol

experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan. El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con procedimientos estándar de 20. 1. Preparativos Cultivar 17 dpf y 25 dpf larvas de pez cebra Transfer 2 hombres y 2 mujeres adultos de pez cebra (sana, de 3 a 6 meses de edad, de laboratorio AB strain) a un tanque de cruce en la tarde antes del día de travesía. Separar …

Representative Results

Las disecciones de las gónadas se realizaron en AB strain larvas de pez cebra. La figura 1 muestra de tejido gonadal típico de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. En primer lugar, la piel y los músculos de un lado del abdomen se corta para exponer los órganos internos. Después de retirar la masa de los órganos internos, la vejiga natatoria, junto con la gónada permanecen en el maletero. La gónada estaba unido a la parte ventral de vejiga natat…

Discussion

El pez cebra se ha convertido en un modelo de gran alcance y se utiliza ampliamente en el desarrollo y la investigación relacionada con la enfermedad. Los métodos para el aislamiento de los órganos en el pez cebra adultos, tales como cerebro, corazón, gónadas, y el riñón, se han documentado bien 23, 24, 25. Debido al pequeño tamaño y remodelación dinámica de los tejidos gonadales en el larvas de pez cebra, el aislami…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a C Zhang para el cuidado de los peces. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31171074, 31371099 y 31571067 a GP) y por el Proyecto Talento Pujiang (09PJ1401900 a GP).

Materials

Cell culture dish 100 mm Corning 430167 For embryo incubation
20 X EM For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10 Gene 121985 For preparing the 2% agar plates 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026 For RNA isolation 
Meter glass Shen Bo 250 ml For preparing the 2% agar plates 
Microwave Oven Midea M1-211A For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX World Precision Instrument 500341 For dissection
Stereomicroscope Motic SMZ168 For dissection
Pure water equipment Millipore
Ringer’s solution For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette Samco 202, 204
Metal bath QiLinbeier Model GL-150
Microscope Leica  M205 FA For photomicrograph
Centrifuge Eppendorf 5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit  Ambion AM1931 For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I  Sigma AMPD1-1KT For DNA digestion in the RNA solution 
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific #K1631 For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H  Thermo Scientific #EN0202 For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix TOYOBO QPK-201 This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer Ne Drop OD-2000+ Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler Eppendorf AG 22331 Hamburg gene expression profiling

Referencias

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Citar este artículo
Wang, X., Chen, S., Zhang, W., Ren, Y., Zhang, Q., Peng, G. Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue. J. Vis. Exp. (122), e55294, doi:10.3791/55294 (2017).

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