Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

O principal determinante do sexo feminino em selvagem cromossoma peixe-zebra 4 for perdido ou modificado no peixe-zebra domesticado (por exemplo estirpes de laboratório comuns) ^1. Em vez disso, eles têm um sistema de determinação do sexo poligénica acompanhados por factores ambientais tais como a temperatura, a hipoxia, a disponibilidade de alimentos e densidade populacional. As modalidades específicas do desenvolvimento sexual peixe-zebra não são totalmente compreendidos. As questões fundamentais, tais como quando a determinação do sexo do peixe-zebra ocorre, o que o sinal de determinação do sexo primário (s) é / são, e que os genes regulam o primeiro passo de transformação das gónadas permanecem sem resposta ^{2, 3.}

No processo de desenvolvimento sexual peixe-zebra, várias etapas importantes foram reconhecidos. Na fase inicial de desenvolvimento, a partir de 4 HPF (horas após a fertilização) células germinativas primordiais (PGCs) submeter a especificação, a migração para e crista genitalproliferação. Números PGC e interacções recíprocas entre as células germinativas e células somáticas são importantes para a diferenciação gonadal ^4. Aos 13 dpf (dias após a fertilização), as gónadas estão em fase indiferenciada. Por 17 dpf, as gônadas desenvolver em bi-potenciais ovários em ambos os sexos futuras. A transição dependente de apoptose a partir de ovário de testículo começam em 21 a 25 dpf e pode continuar durante várias semanas. Por 35 dpf, o sexo da gónada foi determinada e a produção de gâmetas específicos do sexo está em curso em ambos os ovários e de testículos de ^{5, 6, 7.}

Até à data, diversos genes e os mecanismos de determinação do sexo candidatos têm sido propostos. Proteomics e análise do transcriptoma isolaram muitos genes com expressão dimorfismo sexual e estes genes foram utilizados para estudar diferenciação sexual em peixes-zebra ^8, </sup> ^{9, 10.} Por exemplo, no peixe-zebra larval, o gene cyp19a1a é especificamente expresso no ovário mas não no testículo ^{11, 12.} Além disso, o gene AMH é fracamente expressa nas células da granulosa de folículos do ovário, mas fortemente em células de Sertoli de testículos ^13. Em contraste, o gene de vasa é continuamente expressa nas células germinativas de ambos peixe-zebra macho e fêmea, tornando-o um marcador adequado gonadal ^{14, 15.}

Investigar os níveis de expressão do gene gonadais é fundamental para compreender o mecanismo molecular de determinação e diferenciação sexual, especialmente na fase de ovário bi-potencial ^{3, 9.} No entanto, o pequeno tamanho do peixe-zebra larval e, correspondentemente, pequenas gónadas complicam o isolamento da gónadal tecido para outras análises moleculares. Estudos anteriores usados dissecado região do tronco inteiro entre o opercula e poros anal ^16. Esta preparação, embora contendo gónadas, consiste em vários tecidos e órgãos. Em alternativa, os animais transgénicos com expressão da GFP específica para-gonadal, tais como vasa: EGFP foram usadas para o isolamento de tecido gonadal através de células activadas por fluorescência (FACS) e captura de laser de micro-dissecção ^{17, 18.} Mas a sua aplicação generalizada é limitado. Aqui, descrevemos um procedimento simples para isolar o tecido gonadal dos peixes-zebra larval em 17 dpf e 25 dpf. Nós demonstramos a posição das gónadas no que diz respeito a outros órgãos e isolar as gónadas morfologicamente intactas a partir dos tecidos circundantes. Mostramos ainda mais os genes específicos de gónadas, tais como vasos e cyp19a1a são altamente expresso nas gônadas isolado em comparação com o tecido do tronco por meio de PCR quantitativa (qPCR) análise. O presente protocolo permite a identificação, o isolamento, a purificação de ARN e amplificação de genes específicos gonadais de peixe-zebra larval, permitindo assim a análise molecular subsequente de tecido gonadal ^19.