Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Le principal déterminant du sexe féminin dans le chromosome 4 est sauvage zebrafish perdu ou modifié dans le poisson zèbre domestique (c. -à- souches de laboratoire communes) ^1. , Ils ont plutôt un système de détermination du sexe polygénique accompagnée par des facteurs environnementaux tels que la température, l'hypoxie, la disponibilité alimentaire et de la densité de la population. ne sont pas pleinement compris les mécanismes détaillés de développement sexuel poisson zèbre. Des questions fondamentales telles que lors de la détermination du sexe se produit, ce poisson zèbre le signal primaire de détermination du sexe (s) est / sont et quels gènes régulent la première étape de la transformation des gonades reste à répondre ^{2, 3.}

Dans le processus de développement sexuel poisson zèbre, plusieurs étapes importantes ont été reconnues. Au début du stade de développement, à partir de 4 HPF (heures de fécondation) des cellules germinales primordiales (PGC) sont soumises à la spécification, la migration vers la crête génitale etprolifération. Les nombres de PGC et les interactions réciproques entre les cellules germinales et les cellules somatiques sont importantes pour la différenciation des gonades ^4. A 13 dpf (jours de la fécondation), les gonades sont au stade indifférencié. Par 17 dpf, les gonades se développent dans les ovaires bi potentiel dans les deux futures femmes et les hommes. La transition dépendant de l'apoptose de l'ovaire à testiculaire commencent à 21 à 25 dpf et peut se poursuivre pendant plusieurs semaines. Par 35 dpf, le sexe de la gonade a été déterminée et la production de gamètes spécifique du sexe est en cours dans les deux ovaires et les testicules ^{5, 6, 7.}

À ce jour, divers gènes candidats et les mécanismes de détermination du sexe ont été proposées. Protéomique et l' analyse de transcriptome ont isolé plusieurs gènes dont l' expression dimorphisme sexuel et ces gènes ont été utilisés pour étudier la différenciation sexuelle chez le poisson zèbre ^8, </sup> ^{9, 10.} Par exemple, chez le poisson zèbre larvaire, le gène cyp19a1a est exprimé spécifiquement dans l'ovaire , mais pas dans le testicule ^{11, 12.} De plus, le gène de l' AMH est faiblement exprimé dans les cellules granuleuses des follicules ovariens, mais fortement dans les cellules de Sertoli testiculaires ^13. En revanche, le gène de vasa est exprimé en continu dans les cellules germinales à la fois le poisson zèbre mâle et femelle, ce qui en fait un marqueur de gonade approprié ^{14, 15.}

Enquête sur les niveaux d'expression du gène gonadiques est essentiel pour comprendre le mécanisme moléculaire de la détermination du sexe et de la différenciation en particulier au stade de l' ovaire bi-potentiel ^{3, 9.} Cependant, la petite taille du poisson zèbre larvaire et des gonades de façon correspondante de petits compliquer l'isolement des gonadal tissu pour une analyse plus poussée moléculaire. Des études antérieures utilisées toute la région du tronc disséqués entre les opercules et pores anal ^16. Cette préparation, bien que contenant gonades, se compose de plusieurs tissus et organes. En variante, des animaux transgéniques avec expression de GFP spécifique de gonade tels que vasa: EGFP ont été utilisés pour l' isolement des tissus gonadiques par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et des micro-dissection par capture laser ^{17, 18.} Mais leur application à grande échelle est limitée. Ici, nous décrivons une procédure simple pour isoler gonades des larves de poisson zèbre à 17 dpf et 25 dpf. Nous démontrons la position des gonades par rapport à d'autres organes et d'isoler les gonades des tissus environnants morphologiquement intacts. Nous montrons en outre les gènes spécifiques gonades tels que Vasa et cyp19a1a sont fortement exprimés dans les gonades isolées par rapport au tissu du tronc par PCR quantitative (analyse qPCR). Le présent protocole permet l' identification, l' isolement, la purification de l' ARN et l' amplification de gènes spécifiques des gonades de poisson zèbre larvaire, ce qui permet une analyse moléculaire ultérieure du tissu gonadique ^19.