Summary

Génération d'Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Published: January 01, 2017
doi:

Summary

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont très prometteurs pour la modélisation des maladies et des thérapies régénératrices. Nous avons précédemment rapporté l'utilisation de vecteurs épisomiques (EV) pour générer CSPi sans intégration-à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PB MNC). Les vecteurs épisomiques utilisés sont des plasmides d'ADN incorporés avec oriP et EBNA1 éléments provenant du virus d' Epstein-Barr (EB), qui permettent la réplication et à long terme retainment de plasmides dans des cellules de mammifères, respectivement. Avec une optimisation plus poussée, des milliers de colonies iPSC peuvent être obtenus à partir de 1 ml de sang périphérique. Deux facteurs essentiels pour atteindre l'efficacité élevée de reprogrammation sont: 1) l'utilisation d'un 2A "auto-clivage" peptide pour relier OCT4 et SOX2, réalisant ainsi l'expression équimolaire des deux facteurs; 2) l'utilisation de deux vecteurs pour exprimer MYC et KLF4 individuellement. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour générer iP sans intégration,SCs à partir d'échantillons périphériques adultes de sang. Les CSPi générées sont libres d'intégration, comme des plasmides épisomiques résiduels sont indétectables après cinq passages. Bien que l'efficacité de reprogrammation est comparable à celle du virus Sendai (SV) des vecteurs, des plasmides EV sont beaucoup plus économiques que les vecteurs SV disponibles dans le commerce. Ce système EV de reprogrammation abordable détient un potentiel pour des applications cliniques en médecine régénératrice et fournit une approche pour la reprogrammation directe des multinationales PB aux cellules sans intégration-mésenchymateuses souches, les cellules souches neurales, etc.

Introduction

Après l'expression forcée de plusieurs facteurs de transcription (C. -à- OCT4, SOX2, MYC et KLF4), les cellules somatiques peuvent être reprogrammées pour induits des cellules souches pluripotentes (CISP), qui sont très prometteurs pour des applications en médecine régénérative et la thérapie cellulaire de remplacement 1-3. À ce jour, diverses méthodes ont été développées pour augmenter le taux de reprogrammation 4-7 de succès. vecteurs induite par la reprogrammation virale est largement utilisé pour la production efficace de CSPi, parce que l'intégration virale conduit à un niveau élevé, l'expression stable des facteurs de reprogrammation. Cependant, l' intégration stable de l'ADN du vecteur dans le génome de la cellule peut provoquer une 5 mutagenèse insertionnelle. En outre, l' inactivation insuffisante des facteurs de reprogrammation peut perturber la différenciation des CSPi 8. En tant que tel, l'utilisation de iPSCs sans intégration de facteurs de reprogrammation est impératif, en particulier pour une utilisation dans des applications de thérapie cellulaire.

<p class="jove_content"> Épisomique vecteurs (véhicules électriques) sont largement utilisés dans la production de CSPi sans intégration. L'EV le plus couramment utilisé est un plasmide contenant deux éléments, l' origine de la réplication virale (oriP) et EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), du virus d' Epstein-Barr (EB) virus 9. L'élément oriP favorise la replication du plasmide dans des cellules de mammifère, tandis que l'élément EBNA1 longes le plasmide ADN contenant oriP à l'ADN chromosomique qui permet la séparation de l'épisome au cours de la division de la cellule hôte. En comparaison à d' autres approches sans intégration, y compris les virus Sendai (SV) et la transfection d' ARN, les véhicules électriques possèdent de multiples avantages 5,6,10. Comme l'ADN plasmidique, les véhicules électriques peuvent être facilement produits et modifiés dans la maison, ce qui les rend extrêmement abordable. En outre, la reprogrammation EV est un processus de main-d'œuvre moins depuis une seule transfection avec des véhicules électriques est suffisante pour la production iPSC, alors que plusieurs transfections d'ARN sont nécessaires pour la reprogrammation réussie.

réfibroblastes ermal ont été utilisés dans de nombreuses études de reprogrammation. Cependant, une biopsie de la peau est non seulement un processus invasif et douloureux, mais aussi beaucoup de temps pour développer des cellules à des quantités suffisantes pour la reprogrammation. Plus préoccupant, les cellules de la peau des donneurs adultes ont souvent été exposés à long terme le rayonnement de lumière UV, ce qui peut conduire à des mutations associées à des tumeurs, ce qui limite les demandes de CSPi dérivées de fibroblastes de peau 11,12. Récemment, il a été rapporté que des cellules de peau humaine normale accumulent des mutations somatiques et les gènes du cancer multiples, y compris la plupart des principaux moteurs de carcinomes épidermoïdes cutanés, sont soumis à une forte sélection positive 13.

Contrairement aux fibroblastes de la peau, du sang périphérique (PB), les cellules sont une source de cellules pour une reprogrammation préférable parce que 1) les cellules sanguines peuvent être facilement obtenues par un procédé minimalement invasive, 2) des cellules du sang périphérique sont la descendance des cellules souches hématopoïétiquesrésidant dans la moelle osseuse, ainsi protégé contre les radiations nocives. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PB MNC) peuvent être collectées en une heure de la couche leuco-plaquettaire après une centrifugation à gradient simple à l'aide de Ficoll-Hypaque (1,077 g / mL). Les multinationales PB obtenues sont composées de lymphocytes, monocytes et quelques cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) 14. Bien que les lymphocytes T humains sont l' un des principaux types de cellules dans PB, lymphocytes T matures contiennent des réarrangements du récepteur des cellules T (TCR) des gènes et manquent un génome intact limitant ainsi leur potentiel pour les applications 15,16. Cependant, le rajeunissement des cellules T via la génération iPSC peut avoir des applications potentielles dans chimériques Antigène Receptor (CAR) Thérapie des cellules T 17-19. En comparaison, les CAH ont un génome intact et sont facilement reprogrammable. Bien que seulement 0,01 à 0,1% des cellules dans la circulation périphérique sont CAH, ces cellules peuvent être développées ex vivo dans un milieu qui favorise la prolifération érythrocytaire du erythrcellules progénitrices oid 14.

Dans notre étude précédente, nous avons utilisé le facteur BCL-XL en plus des facteurs Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC et KLF4), ce qui a entraîné une augmentation de 10x PB reprogrammation efficency 20. BCL-XL, également connu sous le nom BCL2L1, est un puissant inhibiteur de la mort cellulaire, par l' activation des caspases 21,22 inhibiteur. Mais, BCL-XL peut aussi jouer un rôle important dans le maintien de la pluripotence 21,22. Récemment, nous avons optimisé notre système EV de reprogrammation en exprimant séparément MYC et KLF4 avec deux vecteurs, ce qui conduit à une augmentation d' environ 100x dans l' efficacité de reprogrammation 23. En utilisant cette méthode, l'efficacité de reprogrammation, définie par le nombre de colonies de départ divisée par le nombre de cellules à transfection, est 0,2 à 0,5% de donneurs sains. Comme suit, nous décrivons la procédure expérimentale détaillée pour générer CSPi sans intégration de-PB.

Protocol

Tous les échantillons PB humains ont été obtenus à partir de donneurs adultes anonymes avec aucune information d'identification disponibles à partir de Tianjin Blood Center avec l'approbation du comité d'éthique de la recherche locale. Plasmide Préparation 1. Endo-free Utiliser un kit de purification de plasmide commercial Maxi pour extraire des vecteurs épisomiques de E. coli conformément au protocole du fabricant. Pour l'étape finale, tampon T…

Representative Results

En utilisant ce protocole, nous pouvons obtenir des centaines de colonies de 1 x 10 5 nucleofected PB MNC (Figures 1A et 1B). L'efficacité de reprogrammation est d' environ 0,2 à 0,5% et les colonies expriment des marqueurs de pluripotence (figures 1C et 1D). CSPi générées en utilisant le protocole décrit sont libres d' intégration et ont la capacité de former tératome composant les 3 couc…

Discussion

L'acquisition d'échantillons de sang provenant de donneurs sains ou de patients est pratique et non invasive, ce qui en fait une source de cellules attrayante pour la recherche fondamentale et la thérapie cellulaire clinique. Ici, nous avons décrit un protocole pour la production hautement efficace de iPSCs libre rapprochement à partir d'échantillons de sang périphérique. Cette approche reproductible et abordable devrait bénéficier le domaine iPSC.

Nous avons signalé qu…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Materials

Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma S0192 Store at 4 °C
Human stem cell factor (SCF) Peprotech 300-07 Store at -20 or -80°C
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech AF-200-03 Store at -20 or -80°C
Eryrthropoietin (EPO) Peprotech 100-64 Store at -20 or -80°C
Insulin growth factor-1 (IGF-1) Peprotech 100-11 Store at -20 or -80°C
Dexamethasone Sigma D4902 Store at -20 or -80°C
1-thioglycerol (MTG) Sigma M6145 Store at -20 or -80°C
DMEM/F12 medium Gibco 112660-012 Store at 4 °C
L-glutamine (100x) Gibco 25030-081 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x) Gibco 15140-122 Store at -20 °C
Non-essential amino acids solution (100x) Gibco 11140-050 Store at 4 °C
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) Peprotech 100-18B Store at -20 or -80°C
ITS (100x) Gibco 41400-045 Store at 4 °C
Ascorbic acid Sigma 49752 Store at -20 °C
DMEM (high glucose) medium Thermo SH30243.01B Store at 4 °C
FBS Hyclone SV30087.01 Store at -40 °C
Ficoll GE Healthcare, SIGMA 17-5442-02 Store at RT
Trehalose  Sigma T9531 Store at 4 °C
DMSO Sigma D2650 Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) Qiagen 12362 Store at RT
IMDM Gibco 21056-023 Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit Lonza VPA-1003 Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C
Sodium butyrate Sigma B5887 Store at -20 or -80°C
ROCK inhibitor Y27632 STEMGENT 04-0012-10 Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8) Gibco A15169-01 Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C
Matrigel BD 354277 Store at -20 or -80°C
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) TransGen Biotech AS111 Store at -20 °C
Cell detachment solution STEMGENT 01-0006 Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension
DAPI Sigma D9542-1MG Store at 4 °C or -20 °C
Anti-nanog-AF488 BD 560791 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
Anti-OCT4 abcam ab19857 Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use
AF488 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A21202 Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when use
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody Biolegend 330610 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 eBioscience 41-8843 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibody eBioscience 11-4011 Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection Kit SiDanSai 1102-100 Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction Kit TIANGEN DP304-02 Store at RT
Trypan Blue solution Sigma T8154 Store at RT
Flow cytometry cell analyzer BD LSRII for flow cytometry analysis
Spinning disk confocal microscope (SDC) PerkinElmer UltraVIEW VOX for confocal imaging
Nucleofection device Lonza Nucleofector 2b for the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010 GE take photo of AP staining in bulk

Referencias

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  4. Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
  5. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
  7. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  8. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
  9. Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
  10. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  11. Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
  12. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
  13. Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
  14. Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
  15. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  16. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  17. Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
  18. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
  19. Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
  20. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
  21. Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
  22. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  23. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
  24. Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
  27. Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
  28. Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
  29. Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
  30. Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
  31. Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
  32. Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
  33. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
  34. Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
  35. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
  36. Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
  37. Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
  38. Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Wen, W., Zhang, J., Chen, W., Arakaki, C., Li, X., Baylink, D., Botimer, G. D., Xu, J., Yuan, W., Cheng, T., Zhang, X. Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. J. Vis. Exp. (119), e55091, doi:10.3791/55091 (2017).

View Video