从人体外周血单个核细胞融合，无诱导多能干细胞的生成方法游离型载体

几个转录因子的强制表达后 （ 即 OCT4，SOX2，MYC和KLF4），体细胞可以被重新编程诱导多能干细胞（iPS细胞），其保持在再生医学和细胞替代疗法^1-3应用大有希望。迄今为止，多种方法已被开发，以提高重编程^4-7的成功率。病毒载体诱导重新编程被广泛地用于有效地产生iPSCs的，因为病毒整合导致高电平时，重新编程因子的稳定表达。然而，该载体DNA导入细胞基因组的永久整合可能诱发插入诱变^5。此外，重新编程因子失活不足可能扰乱的iPSC分化^8。这样，不重编程因子整合使用的iPSC的是必要的，尤其是对在细胞治疗应用中使用。

<p class="jove_content">附加型载体（电动汽车）被广泛应用于无融合-iPS细胞的产生。最常用的EV是含有两种元素，病毒复制（oriP）和EB核抗原1（EBNA1）的原点，从爱泼斯坦-巴尔（EB）病毒⁹的质粒。的oriP元件促进在哺乳动物细胞中的质粒复制，而EBNA1元件系绳含oriP-质粒DNA的染色体DNA，其允许所述附加体的宿主细胞的分裂过程中的分区。相较于其他自由整合的办法，包括仙台病毒（SV）和RNA转染，电动汽车具备多种优势^5,6,10。作为质粒DNA，电动车可以很容易地生产并在内部修改，使它们非常实惠。此外，电动车进行重新编程是较少的劳动密集的过程，因为与电动汽车的单个转染足以的iPSC产生，而几的RNA转染所必需的成功重新编程。

ðermal成纤维细胞已在许多重编程研究中使用。然而，皮肤活检不仅是一种侵入性和痛苦的过程，而且还费时扩大细胞足够的数量进行重新编程。更令人关注的，成年供体的皮肤细胞经常被暴露于长期紫外光辐射，这可能会导致与肿瘤有关，从而限制了从皮肤成纤维细胞^11,12衍生的iPSC应用突变。最近，已经报道，人正常皮肤细胞积累的体细胞突变与多种癌症的基因，包括大多数皮肤鳞状细胞癌的主要驱动力，是在强正选择^13。

在对比皮肤成纤维细胞，外周血（PB）的细胞是细胞重新编程的一个优选来源，因为1）血细胞可以通过微创方法来容易地得到，2）的外周血细胞是造血干细胞的后代居住在骨髓，从而防止有害的辐射。外周血单核细胞（PB跨国公司）可以在从血沉棕黄层层以下用Ficoll-Hypaque上（1.077克/ mL）的一个简单的梯度离心一小时进行收集。得到的PB跨国公司是由淋巴细胞，单核细胞和少数造血祖细胞（高性能计算机^）14。虽然人类T淋巴细胞是在PB中的主要细胞类型中的一种，成熟T细胞中含有的T细胞受体（TCR）基因重排和缺一个完整的基因组中从而限制其应用程序^15,16的潜力。然而，通过iPSC的生成T细胞的复兴可能在嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法^17-19潜在的应用。相比较而言，高性能计算机有一个完整的基因组，并很容易重新编程的。虽然只有0.01 – 0.1％，外周循环细胞是高性能计算机，这些细胞可被体外扩增在红细胞中有利于erythr的增殖OID祖细胞^14。

在我们以前的研究中，我们所用的因子的BCL-XL在除山因子（OCT4，SOX2，MYC和KLF4），这导致在PB中重编程efficency ²⁰ 10倍的增加。 BCL-X L，也称为BCL2L1，是细胞死亡的有效抑制剂，通过抑制胱天蛋白酶^21,22的激活。但是，BCL-X L也可以在维持多潜能^21,22发挥着重要作用。最近，我们已进一步通过分别表达MYC和KLF4与两个向量，这导致在重新编程的效率²³的大致100倍增加优化了EV重新编程系统。使用该方法，重编程效率，由通过在转染起始细胞数除以细胞集落数来定义，是0.2 – 来自健康供体的0.5％。如下，我们描述了从PB生成自由整合，iPSCs的详细的实验步骤。