جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات
Summary
This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Abstract
الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) على وعود كبيرة للنمذجة المرض وعلاجات التجدد. ذكرنا فيما سبق استخدام Episomal المتجهات (EV) لتوليد iPSCs خالية من التكامل من الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PB الشركات المتعددة الجنسيات). ناقلات episomal المستخدمة هي البلازميدات الحمض النووي تدمج مع oriP وEBNA1 عناصر من فيروس ابشتاين بار (EB)، والتي تسمح للنسخ المتماثل وطويلة الأجل احتفاظه من البلازميدات في خلايا الثدييات، على التوالي. مع مزيد من التحسين، ويمكن الحصول على الآلاف من المستعمرات IPSC من 1 مل من الدم المحيطي. اثنين من العوامل الحاسمة لتحقيق كفاءة عالية برمجة هي: 1) استخدام 2A "انشقاق عن النفس" الببتيد لربط OCT4 وSOX2، وبالتالي تحقيق التعبير متساوي المولية للعاملين. 2) استخدام متجهين للتعبير عن MYC وKLF4 بشكل فردي. نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد خالية من التكامل الملكية الفكريةالمنبوذة من عينات الدم المحيطي الكبار. وiPSCs ولدت خالية من التكامل كما البلازميدات episomal المتبقية لا يمكن اكتشافها بعد خمسة مقاطع. وعلى الرغم من كفاءة إعادة برمجة هي مماثلة لتلك التي من سينداي فيروس (SV) ناقلات، البلازميدات EV هي إلى حد كبير أكثر اقتصادا من ناقلات SV المتاحة تجاريا. يحمل هذا النظام EV إعادة برمجة بأسعار معقولة المحتملين للتطبيقات السريرية في الطب التجديدي، ويقدم نهجا لإعادة برمجة مباشرة من الشركات المتعددة الجنسيات PB إلى الخلايا خالية من التكامل الجذعية الوسيطة، والخلايا الجذعية العصبية، وما إلى ذلك.
Introduction
بعد التعبير القسري لعدة عوامل النسخ (أي OCT4، SOX2، MYC وKLF4)، الخلايا الجسدية يمكن برمجتها لالناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، الذي عقد الوعد العظيم للتطبيقات في الطب التجديدي وخلية العلاج ببدائل 1-3. حتى الآن، وقد وضعت أساليب متنوعة لزيادة نسبة نجاح إعادة برمجة 4-7. يستخدم ناقلات فيروسية يسببها إعادة البرمجة على نطاق واسع لتوليد كفاءة iPSCs، لأن التكامل الفيروسي يؤدي إلى مستوى عال والتعبير مستقر من العوامل برمجة. ومع ذلك، والتكامل الدائمين في الحمض النووي ناقلات في جينوم الخلية قد تحفز الطفرات إقحامي 5. وبالإضافة إلى ذلك، تعطيل كافية من عوامل إعادة برمجة قد تزعج iPSCs التمايز 8. على هذا النحو، واستخدام iPSCs دون إدماج العوامل برمجة أمر لا بد منه، وخاصة للاستخدام في التطبيقات العلاج بالخلايا.
<p class="jove_content"> Episomal المتجهات (المركبات الكهربائية) وتستخدم على نطاق واسع في توليد iPSCs خالية من التكامل. وEV الأكثر شيوعا هو البلازميد التي تحتوي على عنصرين أو الأصل من تكاثر الفيروس (oriP) وEB النووية مستضد 1 (EBNA1)، من فيروس ابشتاين بار (EB) 9. العنصر oriP يعزز تكرار البلازميد في خلايا الثدييات، بينما العنصر EBNA1 الحبال البلازميد الحمض النووي التي تحتوي على oriP على الحمض النووي الكروموسومات التي تسمح للتقسيم ويصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة. بالمقارنة بنهج خالية من التكامل الأخرى، بما في ذلك سينداي فيروس (SV) وترنسفكأيشن الحمض النووي الريبي، المركبات الكهربائية تمتلك مزايا متعددة 5،6،10. كما DNA البلازميد، المركبات الكهربائية يمكن أن تنتج بسهولة وتعديلها في المنزل، مما يجعلها بأسعار معقولة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة برمجة مع EV هي عملية أقل كثيفة العمالة منذ ترنسفكأيشن واحد مع المركبات الكهربائية غير كافية لتوليد التوجيهية، في حين ضرورية لإعادة البرمجة ناجحة عدة تعداء الحمض النووي الريبي.دوقد استخدمت الخلايا الليفية ermal في العديد من الدراسات برمجة. ومع ذلك، خزعة الجلد ليست فقط عملية الغازية ومؤلمة، ولكن أيضا وقتا طويلا لتوسيع الخلايا على كميات كافية لإعادة البرمجة. من قلق أكبر، وغالبا ما تتعرض خلايا الجلد من المانحين الكبار للإشعاع الأشعة فوق البنفسجية طويلة الأجل، مما قد يؤدي إلى حدوث طفرات المرتبطة الأورام، مما يحد من طلبات iPSCs المستمدة من الخلايا الليفية الجلد 11،12. مؤخرا، تم الإبلاغ عن أن خلايا الجلد البشري العادية تتراكم الطفرات الجسدية وجينات السرطان متعددة، بما في ذلك أكثر من الدوافع الرئيسية لالجلدية سرطان الخلايا الحرشفية، تحت اختيار إيجابية قوية (13).
وعلى النقيض من الخلايا الليفية الجلد والدم المحيطي (PB) الخلايا هي مصدر الأفضل الخلايا لإعادة برمجتها ل1) خلايا الدم يمكن الحصول عليها بسهولة من خلال عملية التنظيرية، 2) خلايا الدم الطرفية هي سلالة من الخلايا الجذعية المكونة للدمالمقيمين في نخاع العظام، وبالتالي حمايتها من الأشعة الضارة. الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PB الشركات المتعددة الجنسيات) يمكن جمعها في ساعة واحدة من طبقة معطف الشهباء بعد الطرد المركزي التدرج بسيط باستخدام Ficoll-Hypaque (1.077 غرام / مليلتر). وتتكون الشركات المتعددة الجنسيات PB التي تم الحصول عليها من اللمفاويات، وحيدات وعدد قليل من الخلايا المكونة للدم السلف (HPCS) 14. على الرغم من أن الخلايا اللمفية تي الإنسان هي واحدة من أنواع الخلايا الرئيسية في الجريدة الرسمية، ناضجة تحتوي على خلايا T إعادة ترتيب الخلية مستقبلات T (TCR) الجينات وتفتقر إلى الجينوم سليمة مما يحد من قدرتها على التطبيقات 15،16. ومع ذلك، قد يكون تجديد خلايا T عبر الجيل IPSC التطبيقات المحتملة في همي مستضد مستقبلات (CAR) علاج خلايا T 17-19. في المقابل، HPCS لها الجينوم سليمة وغير قابل للبرمجة بسهولة. على الرغم من أن فقط 0،01-،1٪ الخلايا في الدورة الدموية الطرفية هي HPCS، وهذه الخلايا يمكن توسيع فيفو السابقين في المتوسط محمر التي تفضل انتشار erythrالخلايا الاولية إمكانية احتواء 14.
في دراستنا السابقة، استخدمنا عامل بي سي إل-XL بالإضافة إلى العوامل ياماناكا (OCT4، SOX2، MYC وKLF4)، مما أدى إلى زيادة 10X في الجريدة الرسمية برمجة الكفاءه 20. بي سي إل-XL، المعروف أيضا باسم BCL2L1، هو المانع من امكانات موت الخلايا، عن طريق تثبيط تفعيل caspases 21،22. ولكن، بي سي إل-XL قد تلعب أيضا دورا هاما في الحفاظ على تعدد القدرات 21،22. في الآونة الأخيرة، لدينا المزيد الأمثل لدينا نظام EV إعادة برمجة بالإعراب بشكل منفصل MYC وKLF4 مع متجهين، الأمر الذي يؤدي إلى زيادة 100X تقريبا في كفاءة إعادة برمجة 23. باستخدام هذا الأسلوب، وكفاءة برمجة، يحددها عدد مستعمرة مقسوما بدءا عدد الخلايا في ترنسفكأيشن، هو 0،2-0،5٪ من المتبرعين الأصحاء. على النحو التالي، ونحن تصف الإجراء التجريبي التفصيلي لتوليد iPSCs خالية من التكامل من الجريدة الرسمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحصول على عينات الدم من المتبرعين الأصحاء أو المرضى غير مريحة وموسع، مما يجعلها مصدر خلية جذابة للبحوث الأساسية والعلاج بالخلايا السريري. هنا وصفناها بروتوكول لتوليد كفاءة عالية من iPSCs خالية من التكامل من عينات الدم الطرفية. هذا النهج استنساخه وبأسعار معقولة ينبغي…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Materials
| Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
| Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
| Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
| Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
| L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
| ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
| Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
| DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
| FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
| Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
| ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
| Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
| Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
| Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
| Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
| PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
| Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
| Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
| Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |
Referencias
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
- Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
- Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
- Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
- Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
- Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
- Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
- Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
- Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
- Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
- Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
- Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
- Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
- Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).
