Génération d'Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Après l'expression forcée de plusieurs facteurs de transcription (C. -à- OCT4, SOX2, MYC et KLF4), les cellules somatiques peuvent être reprogrammées pour induits des cellules souches pluripotentes (CISP), qui sont très prometteurs pour des applications en médecine régénérative et la thérapie cellulaire de remplacement ^1-3. À ce jour, diverses méthodes ont été développées pour augmenter le taux de reprogrammation ^4-7 de succès. vecteurs induite par la reprogrammation virale est largement utilisé pour la production efficace de CSPi, parce que l'intégration virale conduit à un niveau élevé, l'expression stable des facteurs de reprogrammation. Cependant, l' intégration stable de l'ADN du vecteur dans le génome de la cellule peut provoquer une ⁵ mutagenèse insertionnelle. En outre, l' inactivation insuffisante des facteurs de reprogrammation peut perturber la différenciation des CSPi ^8. En tant que tel, l'utilisation de iPSCs sans intégration de facteurs de reprogrammation est impératif, en particulier pour une utilisation dans des applications de thérapie cellulaire.

<p class="jove_content"> Épisomique vecteurs (véhicules électriques) sont largement utilisés dans la production de CSPi sans intégration. L'EV le plus couramment utilisé est un plasmide contenant deux éléments, l' origine de la réplication virale (oriP) et EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), du virus d' Epstein-Barr (EB) virus ^9. L'élément oriP favorise la replication du plasmide dans des cellules de mammifère, tandis que l'élément EBNA1 longes le plasmide ADN contenant oriP à l'ADN chromosomique qui permet la séparation de l'épisome au cours de la division de la cellule hôte. En comparaison à d' autres approches sans intégration, y compris les virus Sendai (SV) et la transfection d' ARN, les véhicules électriques possèdent de multiples avantages ^5,6,10. Comme l'ADN plasmidique, les véhicules électriques peuvent être facilement produits et modifiés dans la maison, ce qui les rend extrêmement abordable. En outre, la reprogrammation EV est un processus de main-d'œuvre moins depuis une seule transfection avec des véhicules électriques est suffisante pour la production iPSC, alors que plusieurs transfections d'ARN sont nécessaires pour la reprogrammation réussie.

réfibroblastes ermal ont été utilisés dans de nombreuses études de reprogrammation. Cependant, une biopsie de la peau est non seulement un processus invasif et douloureux, mais aussi beaucoup de temps pour développer des cellules à des quantités suffisantes pour la reprogrammation. Plus préoccupant, les cellules de la peau des donneurs adultes ont souvent été exposés à long terme le rayonnement de lumière UV, ce qui peut conduire à des mutations associées à des tumeurs, ce qui limite les demandes de CSPi dérivées de fibroblastes de peau ^11,12. Récemment, il a été rapporté que des cellules de peau humaine normale accumulent des mutations somatiques et les gènes du cancer multiples, y compris la plupart des principaux moteurs de carcinomes épidermoïdes cutanés, sont soumis à une forte sélection positive ^13.

Contrairement aux fibroblastes de la peau, du sang périphérique (PB), les cellules sont une source de cellules pour une reprogrammation préférable parce que 1) les cellules sanguines peuvent être facilement obtenues par un procédé minimalement invasive, 2) des cellules du sang périphérique sont la descendance des cellules souches hématopoïétiquesrésidant dans la moelle osseuse, ainsi protégé contre les radiations nocives. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PB MNC) peuvent être collectées en une heure de la couche leuco-plaquettaire après une centrifugation à gradient simple à l'aide de Ficoll-Hypaque (1,077 g / mL). Les multinationales PB obtenues sont composées de lymphocytes, monocytes et quelques cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) ^14. Bien que les lymphocytes T humains sont l' un des principaux types de cellules dans PB, lymphocytes T matures contiennent des réarrangements du récepteur des cellules T (TCR) des gènes et manquent un génome intact limitant ainsi leur potentiel pour les applications ^15,16. Cependant, le rajeunissement des cellules T via la génération iPSC peut avoir des applications potentielles dans chimériques Antigène Receptor (CAR) Thérapie des cellules T ^17-19. En comparaison, les CAH ont un génome intact et sont facilement reprogrammable. Bien que seulement 0,01 à 0,1% des cellules dans la circulation périphérique sont CAH, ces cellules peuvent être développées ex vivo dans un milieu qui favorise la prolifération érythrocytaire du erythrcellules progénitrices oid ^14.

Dans notre étude précédente, nous avons utilisé le facteur BCL-XL en plus des facteurs Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC et KLF4), ce qui a entraîné une augmentation de 10x PB reprogrammation efficency ^20. BCL-XL, également connu sous le nom BCL2L1, est un puissant inhibiteur de la mort cellulaire, par l' activation des caspases ^21,22 inhibiteur. Mais, BCL-XL peut aussi jouer un rôle important dans le maintien de la pluripotence ^21,22. Récemment, nous avons optimisé notre système EV de reprogrammation en exprimant séparément MYC et KLF4 avec deux vecteurs, ce qui conduit à une augmentation d' environ 100x dans l' efficacité de reprogrammation ^23. En utilisant cette méthode, l'efficacité de reprogrammation, définie par le nombre de colonies de départ divisée par le nombre de cellules à transfection, est 0,2 à 0,5% de donneurs sains. Comme suit, nous décrivons la procédure expérimentale détaillée pour générer CSPi sans intégration de-PB.