Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

A tecnologia de hibridoma apresentadas neste protocolo foi descrita pela primeira vez por Kohler e Milstein ¹ em 1975 e, com exceção de algumas melhorias técnicas, do processo principal não mudou dramaticamente durante os últimos 40 anos ^2. O objectivo do presente protocolo é a explicar uma estratégia mais adequada a imunização, um método padrão para a geração de anticorpos monoclonais, e um exemplo de um método de validação (ELISA).

Os anticorpos são ferramentas incrível e contribuem para uma grande variedade de abordagens tecnológicas, tais como citometria de fluxo, separação de células magnético, ou imunofluorescência, bem como para possibilidades de diagnóstico e terapêuticas para o controlo e tratamento da doença ^3. A disponibilidade comercial de anticorpos monoclonais para os alvos desejados é demonstrada pela presença de mais de 24 bases de dados da web com diferentes quantidades de cerca de inúmeros anticorpos ou de produtos relacionados com o Anticorpo ^4. Em 2015, ummoléculas ntibody eram parte de uma discussão internacional ^5-7 devido a problemas graves na validação adequada e caracterização de anticorpos disponíveis comercialmente.

Pode ser difícil e caro para encontrar os anticorpos específicos para um antigénio alvo, e, muitas vezes, eles não têm a afinidade ou especificidade necessárias. Apesar de gerar um anticorpo ainda é demorado e requer pessoal qualificado para desenvolver e validar o anticorpo, produzindo um anticorpo individualmente poderia melhor do que comprar um.

Devido ao facto de a produção de anticorpos é demorada e exige experiência, foram desenvolvidos métodos alternativos para a produção de moléculas de ligação para superar estes problemas. O método alternativo mais utilizada é a produção recombinante de anticorpos de cadeia simples através de apresentação de fagos. Os genes para a região variável de ligação são extraídos a partir de células e combinado com a proteína de revestimento de um fago. os single cadeia é então expresso na superfície de uma bacteriófago e rastreados em vários passos panning ^8. A produção de anticorpos de cadeia única é um pouco mais rápido, mas também requer um experimentalista especializado. As desvantagens de alguns anticorpos de cadeia simples recombinantes são fraca estabilidade e falta de aptidão para o diagnóstico in vitro. Na maioria dos testes de diagnóstico, um receptor de Fc para detecção é necessário, o que tem de ser adicionado a um anticorpo de cadeia única recombinante depois. Mais uma vez, esta é morosa e ainda mais complexa do que a técnica de hibridoma. Em diagnóstico in vitro, de anticorpos de comprimento completo monoclonal de ratinho e de coelho foram demonstradas para ser a melhor escolha.

Um dos principais passos na geração de anticorpos monoclonais deve ser feito antes que o trabalho começa no laboratório: o desenho do imunoconjugado. Questões que precisam ser abordadas são: Qual é a composição física do alvo na última application, e em que as matrizes estão presentes? Onde a concentração será o alvo tem na sua aplicação? Qual é a aplicação final, e quais são os requisitos que o anticorpo deve cumprir?

Ter sempre em conta que, se um fragmento de péptido linear é usado, tem também de ser linear, no epitopo final no alvo de escolha; caso contrário, o anticorpo não se ligarão. Claro que, independentemente do método de rastreio, os anticorpos podem ser seleccionadas para reconhecer diferentes formatos antigénicos em diferentes aplicações, mas este deve ser validado de forma muito precisa. Estas são as razões pelas quais o desenvolvimento de anticorpos e validação são tais processos ambiciosos.

A escolha do formato antigénico para a imunização é fundamental para o desenvolvimento de anticorpos e determina o sucesso ou a falha do presente processo. Uma vez que os ratinhos expressam um título de anticorpo necessário, as células do baço são isoladas e fundidas com células de mieloma. As linhas celulares de mieloma mais comuns paradesenvolvimento anticorpo monoclonal murino são X63-Ag 8.653 ⁹ e Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ a partir de um / c estirpe de ratinhos Balb. As células são descendentes de um linfoma de células B malignas e foram selecionados porque eles não secretam qualquer de suas próprias cadeias pesadas ou leves. As células podem ser adaptadas a uma razão entre 1:10 e 10: 1 (em comparação com células de mieloma esplenócitos). Neste protocolo, as células foram adaptadas para uma proporção de 3: 1 e fundida por polietileno-glicol (PEG) e de electrofusão, de acordo com Stoicheva e Hui ^11.

A fusão de células B e células de mieloma é um processo aleatório. Portanto, dois híbridos de linfócitos B ou duas células de mieloma pode ser gerada, mas esses híbridos não seriam capazes de sobreviver durante um longo período de tempo em cultura. As células passam por uma selecção de hipoxantina, aminopterina, e timidina (HAT), pelo que apenas as células de hibridoma fundidas podem sobreviver devido à possibilidade de utilizar a via de novo da síntese de pirimidina. Para a geração de monoclonal anticorpos, é necessário para obter uma linha de células proveniente de uma célula mãe. O monoclonalidade é assegurada por limitar as técnicas de diluição e a análise microscópica de crescimento celular. Os sobrenadantes da cultura de hibridoma são rastreados quanto à produção de anticorpos específicos, principalmente por meio de ELISA ou citometria de fluxo, e os melhores ligantes são seleccionados. Após cultura em massa e a purificação, a molécula de anticorpo pode, finalmente, ser caracterizado e validado para a aplicação desejada.