Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Bu protokol sunulan hibridoma teknolojisi ilk Köhler ve 1975 yılında Milstein ¹ tarafından tarif edilmiştir ve bazı teknik iyileştirmeler dışında, ana prosedür son 40 yıl ² sırasında önemli ölçüde değişmedi. Bu protokolün amacı, daha uygun bir aşı stratejisi, monoklonal antikorların üretilmesi için standart bir yöntem ve bir doğrulama yöntemi (ELISA) için bir örnek açıklamaktır.

Antikorlar inanılmaz araçlar ve hastalık izleme ve tedavi ³ tanı ve tedavi seçenekleri yanı sıra, bu tür flow sitometri, manyetik hücre sıralama, ya da immünofloresan gibi teknolojik yaklaşımlar, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. İstenilen hedeflere yönelik monoklonal antikorların, ticari uygunluk antikorlar veya antikor-ilgili ürünlerin ⁴ yaklaşık sayısız miktarlarda 24 farklı bir web veri tabanları varlığı ile ortaya konmuştur. 2015 yılında, birntibody moleküller nedeniyle uygun doğrulama ve piyasada mevcut antikorların karakterizasyonu ciddi sorunlara uluslararası bir tartışmanın ^5-7 parçasıydı.

Hedef bir antijen için spesifik antikorları bulmak zor ve pahalı olabilir, ve genellikle, bu afinite ve özgüllük gerekli bulunmamaktadır. Bir antikor üreten hala zaman alıcı ve kudret daha iyi bir satın alma daha ayrı bir antikor üreten, geliştirmek ve antikor doğrulamak için kalifiye personele ihtiyaç duyar rağmen.

Nedeniyle antikor üretimi zaman alıcıdır ve deneyim gerektirir olması, bağlama moleküllerinin üretimi için alternatif yöntemler, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan alternatif bir yöntem, faj gösterimi ile, tek zincirli antikorların rekombinant üretimi. Değişken bağlayıcı bölge genleri hücrelerinden ekstre edilmiş ve bir faj kaplama proteini ile bir araya getirilmektedir. sIngle zinciri daha sonra bakteriyofaj yüzeyi üzerinde ifade edilir ve birden fazla kaydırma adımda ⁸ taranır. Tek zincirli antikorların üretimi daha hızlıdır, ancak, aynı zamanda, bir uzman deneye gerektirir. Bazı biraraya getiren tek zincirli antikorların dezavantajları kötü istikrar ve in vitro diagnostik için uygunluk eksikliği vardır. En tanısal testlerde, saptama için bir Fc-reseptörü sonradan yeniden birleştirici tek zincirli antikor eklenmesi ihtiyacı olan gereklidir. Yine, bu zaman alıcı ve hibridoma tekniği daha fazla karmaşıktır. In vitro diagnostik, tam uzunlukta monoklonal fare ve tavşan antikorları en iyi seçenek olarak gösterilmiştir.

immüno tasarımı: laboratuarda çalışma başlamadan önce monoklonal antikorların üretilmesi önemli adımlardan biri yapılmalıdır. ele alınması gereken sorular şunlardır: Nihai applicat hedefin fiziksel kompozisyonu nediriyonu ve mevcut olduğu matrisler? hedef uygulamada hangi konsantrasyon olacak? Nihai uygulama nedir ve antikor yerine getirmesi gerektiğini istenenler nelerdir?

Her zaman doğrusal bir peptid fragmanı kullanıldığı takdirde, aynı zamanda seçim hedefi nihai epitop doğrusal gerektiği dikkate almak; aksi halde, bir antikor bağlamayacaktır. Tabii ki, tarama yönteminin, bağımsız olarak, antikorlar, farklı uygulamalarda farklı antijenik biçimleri tanıyan seçilebilir, ancak bu çok kesin doğrulanması gerekir. Bu antikor geliştirme ve doğrulama gibi iddialı süreçlerdir nedenleri vardır.

bağışıklama için antijenik biçimi seçimi antikor gelişimi için esastır ve bu sürecin başarısını veya başarısızlığını belirler. farenin ilgili bir antikor titresi ifade sonra, dalak hücreleri izole edildi ve miyeloma hücreleri ile birleştirilmiştir. En sık miyeloma hücre çizgilerifare monoklonal antikor gelişimi X63-Ag 8,653 ⁹ ve Balb / c fare suşundan SP2 / 0-Ag 14 ¹⁰ vardır. Hücreler malign B hücre lenfoması soyundan ve kendi ağır veya hafif zincirlerinin bir salgılar çünkü seçilmiştir. 1 (miyelom hücreleri karşı splenositler): hücreler 1:10 ile 10 arasında bir oranda uyarlanabilir. Stoicheva Hui ^11'e göre, 1 ve polietilen glikol (PEG) ve elektrofüzyon ile kaynaşık: Bu protokol, hücrelerin 3 bir oranda uyarlanmıştır.

B hücreleri ve miyelom hücrelerinin füzyonu rasgele bir süreçtir. Bu nedenle, iki B lenfositleri ya da iki miyelom hücrelerinin hibridlerinin oluşturulmasına olabilir, ancak bu melez kültürde uzun süre hayatta mümkün olmaz. Hücreleri sadece kaynaşık hibridoma hücreleri nedeniyle pirimidin sentezi de novo yolu kullanan olasılığı dayanabildiği bir hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT) seçimi, tabi tutulur. mon üretimi içinoclonal antikorlar, bir ana hücreden kaynaklanan bir hücre çizgisi elde etmek için gereklidir. monoklonalitenin seyreltme teknikleri ve hücre büyümesinin mikroskobik analizi sınırlayarak sağlanır. hibridom kültür süpernatantları çok ELISA ile spesifik antikor üretimi için ya da akış sitometrisi, ve en iyi bağlayıcılar seçilebilirler. kitle kültürü ve saflaştırmadan sonra, antikor molekülü son karakterize edilebilir ve arzu edilen uygulama için doğrulandı.