Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии

Технология гибридомная , представленная в настоящем протоколе впервые был описан Келером и Мильштейн ¹ в 1975 году , и, за исключением некоторых технических усовершенствований , за исключением того , основная процедура не сильно изменилась за последние 40 лет ^2. Целью данного протокола является разъяснение более подходящей стратегии иммунизации, стандартный метод для генерации моноклональных антител, а также пример для метода проверки (ELISA).

Антитела представляют собой невероятные инструменты и внести свой вклад в широкий диапазон технологических подходов, таких как поточной цитометрии, магнитной сортировки клеток, или иммунофлюоресценции, а также для диагностических и терапевтических возможностей для контроля и лечения заболеваний ^3. Коммерческой доступности моноклональных антител для желаемых целей свидетельствует наличие более чем 24 различных веб – баз данных с почти бесчисленные количества антител или продуктов антител , связанных с ⁴ -х . В 2015 годуntibody молекулы были частью международной дискуссии ^5-7 из – за серьезных проблем в надлежащей проверки и определения характеристик коммерчески доступных антител.

Это может быть трудным и дорогостоящим, чтобы найти специфические антитела для целевого антигена, и часто, они не имеют сродства или специфичности необходимо. Несмотря на то, генерируя антитела по-прежнему отнимает много времени и требует квалифицированного персонала для разработки и проверки антитела, получения антитела по отдельности может лучше, чем покупать один.

В связи с тем, что продукция антител отнимает много времени и требует опыта, были разработаны альтернативные способы получения связывающих молекул, чтобы преодолеть эти проблемы. Наиболее часто используемым альтернативным методом является рекомбинантное получение одноцепочечных антител с помощью фагового дисплея. Гены вариабельной области связывания извлекаются из клеток и в сочетании с белком покрытия фага. В sIngle цепь затем экспрессируется на поверхности бактериофага и подвергают скринингу в нескольких панорамирование ⁸ шагов. Получение одноцепочечных антител немного быстрее, но он также требует квалифицированного экспериментатора. К недостаткам некоторых рекомбинантных одноцепочечных антител являются бедными стабильность и отсутствие пригодности для диагностики в лабораторных условиях . В большинстве диагностических тестов, ЯК-рецептор для обнаружения необходимо, которая должна быть добавлена ​​к рекомбинантным одноцепочечных антител после этого. Опять же, это отнимает много времени и еще более сложным, чем техника гибридом. В диагностике в пробирке, полнометражные моноклональное мыши и антитела кролика были продемонстрированы быть лучшим выбором.

Одним из важнейших шагов в создании моноклональных антител должно быть сделано до того, как работа в лаборатории начинается: дизайн иммуноконъюгата. Вопросы, которые необходимо решить, являются: Каков физический состав мишени в конечном APPLICATиона, и где матрицы присутствуют? Какая концентрация будет иметь цель в приложении? Что такое окончательное приложение, и каковы требования, что антитело должен удовлетворять?

Всегда принимать во внимание, что если используется линейный пептидный фрагмент, он также должен быть линейным в конечном эпитоп в мишени выбора; в противном случае, это антитело не будет связываться. Конечно, независимо от метода скрининга, антитела могут быть выбраны, чтобы распознавать различные антигенные форматы в различных приложениях, но это должно быть подтверждено очень точно. Вот причины, почему антитела разработки и валидации являются такие амбициозные процессы.

Выбор антигенной формата для иммунизации имеет основополагающее значение для развития антител и определяет успех или неудачу этого процесса. После того, как мыши, проявляющие соответствующий титр антител, клетки селезенки выдел ют и сливают с клетками миеломы. Наиболее распространенные миеломы клеточные линии дляРазвитие мышиные моноклональные антитела являются X63-Ag 8,653 ⁹ и Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ из / с мышиного штамма Balb. Клетки происходят от злокачественной лимфомы В-клеток, и были выбраны потому, что они не секретируют какие-либо из своих собственных тяжелой или легкой цепи. Клетки могут быть адаптированы к соотношении от 1:10 до 10: 1 (спленоциты в сравнении с клетками миеломы). В этом протоколе клетки были адаптированы к соотношении 3: 1 , и слитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и электросваркой, в соответствии с Stoicheva и Hui ^11.

Слияние В-клеток и клеток миеломы является случайным процессом. Следовательно, гибриды двух В-лимфоциты или две клетки миеломы может быть сгенерирован, но эти гибриды не смогли бы выжить в течение длительного времени в культуре. Клетки проходят отбор гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), в которой только слитые клетки гибридомы могут выжить из – за возможности использования De Novo пути синтеза пиримидинов. Для поколения пнoclonal антитела, необходимо, чтобы получить линию клеток, происходящих из одной материнской клетки. Моноклональности обеспечивается путем ограничения методов разрежения и микроскопический анализ клеточного роста. Супернатанты культуры гибридомы подвергают скринингу на специфических антител, в основном, с помощью ELISA или проточной цитометрии, и лучшие связующие выбраны. После массовой культуры и очистки, молекула антитела, наконец, могут быть охарактеризованы и утверждены для желаемого применения.