Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Il IBRIDOMA presentato in questo protocollo è stato descritto da Köhler e Milstein ¹ nel 1975 e, ad eccezione di alcuni miglioramenti tecnici, la procedura principale non è cambiata radicalmente nel corso degli ultimi 40 anni ^2. Lo scopo di questo protocollo è quello di spiegare una strategia più appropriata di immunizzazione, un metodo standard per la generazione di anticorpi monoclonali, e un esempio di un metodo di convalida (ELISA).

Gli anticorpi sono strumenti incredibili e contribuiscono ad una vasta gamma di approcci tecnologici, come la citometria a flusso, l'ordinamento delle cellule magnetiche, o immunofluorescenza, nonché alle opzioni diagnostiche e terapeutiche per il monitoraggio e il trattamento della malattia ^3. La disponibilità commerciale di anticorpi monoclonali per il target desiderato è dimostrata dalla presenza di oltre 24 diversi database web con quasi innumerevoli quantità di anticorpi o prodotti anticorpi legati ^4. Nel 2015, unmolecole ntibody facevano parte di un dibattito internazionale ^5-7 a causa di seri problemi in una corretta validazione e caratterizzazione di anticorpi disponibili in commercio.

Può essere difficile e costoso trovare anticorpi specifici per un antigene bersaglio, e spesso, non hanno affinità o la specificità necessaria. Sebbene generando un anticorpo è ancora tempo e richiede personale specializzato per sviluppare e convalidare l'anticorpo, producendo un anticorpo singolarmente potrebbe meglio di acquistare uno.

A causa del fatto che la produzione di anticorpi richiede tempo e richiede esperienza, metodi alternativi per la produzione di molecole di legame sono state sviluppate per superare questi problemi. Il metodo alternativo più comunemente usato è la produzione ricombinante di anticorpi a catena singola con phage display. I geni per la regione di legame variabile vengono estratti dalle cellule e combinati con la proteina di rivestimento di un fago. i scatena ingle viene espresso sulla superficie di un batteriofago e proiettato in diversi passaggi panning ^8. La produzione di anticorpi a catena singola è un po 'più veloce, ma richiede anche un abile sperimentatore. Gli svantaggi di alcuni anticorpi a catena singola ricombinanti sono scarsa stabilità e la mancanza di idoneità della diagnostica in vitro. Nella maggior parte dei test diagnostici, un Fc-recettore per il rilevamento è necessario, che deve essere aggiunto ad un anticorpo a catena singola ricombinante dopo. Di nuovo, questo richiede tempo e ancora più complessa rispetto alla tecnica ibridoma. Nella diagnostica in vitro, full-length monoclonale di topo e di coniglio anticorpi sono stati dimostrato di essere la scelta migliore.

Uno dei principali passi nella generazione di anticorpi monoclonali deve essere fatto prima che il lavoro in laboratorio inizia: il disegno del immunoconiugato. Le domande che devono essere affrontate sono: Qual è la composizione fisica del bersaglio nella Applicat finaleione, e le cui matrici sono presenti? Quale concentrazione target avere nella domanda? Qual è l'applicazione finale, e quali sono i requisiti che l'anticorpo deve soddisfare?

Sempre tener conto che se viene usato un frammento peptidico lineare, deve anche essere lineare nel epitopo finale nella destinazione di scelta; altrimenti, l'anticorpo non si legherà. Naturalmente, indipendentemente dal metodo di screening, anticorpi potrebbero essere selezionati per riconoscere diversi formati antigenici in diverse applicazioni, ma devono essere convalidati molto preciso. Queste sono le ragioni per le quali lo sviluppo di anticorpi e la convalida sono tali processi ambiziosi.

La scelta del formato antigenica per l'immunizzazione è fondamentale per lo sviluppo di anticorpi e determina il successo o il fallimento di questo processo. Una volta che i topi esprimono un rilevante titolo anticorpale, le cellule di milza sono isolati e fusi con cellule di mieloma. Le linee cellulari di mieloma più comunimurino lo sviluppo di anticorpi monoclonali sono X63-Ag 8,653 ⁹ e Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ da una / c ceppo di topi Balb. Le cellule discendono da un linfoma a cellule B maligni e sono stati selezionati perché non secernono qualsiasi delle loro catene pesanti e leggere. Le cellule possono essere adattati ad un rapporto compreso tra 1:10 e 10: 1 (splenociti contro cellule di mieloma). In questo protocollo, le cellule sono state adattate ad un rapporto di 3: 1 e fuse da polietilenglicole (PEG) e elettrofusione, secondo Stoicheva e Hui ^11.

La fusione di cellule B e cellule di mieloma è un processo casuale. Pertanto, ibridi di due B linfociti o due cellule di mieloma potrebbero essere generati, ma questi ibridi non sarebbero in grado di sopravvivere per un lungo tempo di coltura. Le cellule subiscono una selezione ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT), per cui solo le cellule di ibridoma fuse possono sopravvivere grazie alla possibilità di utilizzare il percorso de novo di sintesi delle pirimidine. Per la generazione di monanticorpi oclonal, è necessario ottenere una linea cellulare proveniente da una cellula madre. Il monoclonalità è garantita limitando le tecniche di diluizione e l'analisi microscopica della crescita cellulare. I sovranatanti di ibridoma sono proiettati per la produzione di anticorpi specifici, per lo più da ELISA o citometria a flusso, e le migliori leganti sono selezionati. Dopo cultura di massa e la purificazione, la molecola anticorpo può infine essere caratterizzata e convalidato per l'applicazione desiderata.